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标题:【讨论分享帖】分享你做蛋白质组学实验的protocol

qianqin1977[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家有没有做动物组织双向电泳的啊 ？为什么我的电泳染色后不显影啊 ？请问有谁知道什么原因会导致不显影吗？
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Powdered fruit or peel tissue (0.2 g) was placed in a 2.0 mL microfuge tube and the protein precipitated at 2207C for 45 min with 1.75 mL of a precipitation solution (10%TCA in ice-cold acetone). The precipitated protein was centrifuged for 10 min at 10 0006g at 297C. The supernatant was discarded and the pellet rinsed with 2 mL of ice-cold acetone and stored at 2207C for 1 h to remove residual TCA then further centrifuged for 15 min at 10 0006g at 2207C. Acetone rinses were repeated until a white pellet was obtained. The protein pellet was dried under vacuum for 5 min and then dissolved in varying volumes of buffer containing 5 M urea, 2 M thiourea, 2%CHAPS, 2% N-decyl-N,N-dimethyl-3- ammonio-1-propanesulfonate, 20 mM DTT, 5 mM tris(2- carboxyethyl) phosphine hydrochloride, and two carrier ampholytes 0.5%pH 4–6.5 and 0.25%pH 3–11 nonlinear.
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也发个植物提取的方法！

本人主要做水稻蛋白组学，这是实验室总结的水稻及其它植物蛋白提取的方法，与大家分享！ TCA/丙酮法：液氮研磨每400mg叶片加1mlTCA抽提液（10%TCA，0.07%β-巯基乙醇，丙酮配置，-20摄氏度预冷）——震荡——-20摄氏度沉淀过夜——15000rpm/min离心15min，弃上清。——1ml冷丙酮（含0.07%β-巯基乙醇，-20摄氏度预冷），震荡，——-20摄氏度沉淀2小时，——15000rpm/min离心15min，弃上清——加1ml80%冷丙酮（含0.07%β-巯基乙醇，-20摄氏度预冷）震荡，——-20摄氏度沉淀2小时，——15000rpm/min离心15min，弃上清，——加1ml冷丙酮（含0.07%β-巯基乙醇，-20摄氏度预冷）震荡，——-20摄氏度沉淀2小时，——15000rpm/min离心15min，弃上清，——沉淀真空干燥成干粉，-20摄氏度保存。
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发表于 2012-12-3 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有极端细菌方面的蛋白提取方法？？
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fox_79[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是新手，问个很弱的问题： 苹果果肉蛋白可以做2D电泳吗？为什么看到的文章都是做SDS-PAGE的？是不是等点聚焦时会有问题？
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我通常用TCA/丙酮法
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ending[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，你那里有有关提取植物根蛋白质的方法吗？ 我们实验室是新开始做蛋白质的很多都不成熟，我们的胶要自己配，你那里有详细的配置过程吗？ 如能回答不胜感激，急急急急！ 谢谢！
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发表于 2012-12-3 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，你那里有有关提取植物根蛋白质的方法吗？ 我们实验室是新开始做蛋白质的很多都不成熟，我们的胶要自己配，你那里有详细的配置过程吗？ 如能回答不胜感激，急急急急！ 谢谢！



你指的是一向还是二向胶？
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发表于 2012-12-3 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做细菌蛋白的,小小献丑一下 试剂： 1. 10mM Tris/HCl pH 7.0 2. 样品溶解液 8M尿素 2M硫脲 50mM DTT 2% CHAPS 0.2% Carrier Ampholytes 3-10 0.00025%溴酚兰 SW定容至25ml 3. 冰丙酮 一.抽提蛋白 1.平板上挑取单菌落接种液体培养基，过夜培养； 2.1：100接种100ml菌液，培养14h； 3.5000rpm， 4℃离心5min收集菌体，20mM Tris/HCl洗三次，重悬于5mlTris/HCl； 4.超声波裂解：power level 5，3min/次，裂解4次； 5.加入DNaseⅠ，RNaseA37℃，作用30min； 6.加入20ml样品溶解液溶解； 7.溶解的样品13,000g, 4℃离心20min，取上清； 8.加入三倍体积丙酮-20℃沉淀2h以上； 9.13,000g, 4℃离心20min，收集沉淀； 10.用冰丙酮洗三次，保存于-20℃备用。 二.Bradford法测定蛋白浓度 1）称取0.01g 菌体蛋白，用350μl样品溶解液彻底溶解； 2）8,000 rpm，4℃，3min 离心，取上清； 3）称取3mg BSA溶解于3ml超纯水中，在试管中依次稀释为0，200，400，600，800，1000μg/ml的标准液各100μl； 4）样品蛋白分别稀释20倍和50倍，取100μl备用； 5）在100μl BSA和样品稀释液中各加5ml Bradford工作液，振荡器混匀； 6）打开TU-1810紫外分光光度计，测定BSA标准曲线,测定样品稀释液浓度； 三.被动水化12h 四.聚焦电压模式设置： S1 250v 慢速 30min 除盐 S2 1000v 快速 60min 除盐 S3 4000v 线性 3h 升压 S4 4000v 快速 24,000伏小时 聚焦 S5 500v 快速 任意时间 保持 选择放置的胶条数； 每根胶条的极限电流40μA； 等电聚焦温度：17℃。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

操作步骤 一、        处理标本 －80°C 取出标本置于碎冰盒中 加入PMSF30ul，PBS1ml洗涤，共3次，滤纸吸干（重复三次），至上清无红细胞 (开启冷冻离心机预冷) 将组织剪碎后移至匀浆器（高压灭菌）中，加入30ul ,1mol/l PH6.8Tris –碱冰浴中完全匀浆 加入NE5ul，室温下匀浆，室温放置20-30min 最后5分钟，现配裂解液（上样缓冲液I 1ml ，DTT 0.012g ，IPG buffer 5ul ，蛋白酶抑制剂 10ul） 分次加入裂解液，冰浴匀浆 匀浆器低速离心1500r/min ×5min（Wash I－20°C预冷） 吸取匀浆液至1.5mlEP管（4°C，12000r/min×30min） 吸取上清（200ul枪至1.5mlEP管中），记录体积 加入3倍体积的沉淀剂I（precipitating agent I）漩涡混匀，冰上孵育15min 加入3倍体积的沉淀剂II（precipitating agent II）漩涡混匀，12000r/min×5min倒掉上清，滤纸吸弃液体 蛋白颗粒向外，高速离心15-30s，小枪吸掉上清 加入3-4倍于颗粒体积（4oul）的洗剂I（wash reagent I），漩涡混匀，彻底洗涤蛋白颗粒 12000r/min×5min，小枪吸弃液体 加足够聚合蛋白颗粒的超纯水（25ul），不应太多，漩涡混匀 加入－20°C预冷至少1hr的洗剂II1ml（为样本量的10倍，也至少为加水量的10倍） 加入洗剂II辅助剂（wash II additive）5ul，漩涡1min，－20°C孵育30min，每隔10min漩涡一次（20-30s/次） 12000r/min×5min，吸弃液体，瞬时离心15-30s，彻底吸弃洗涤剂室温风干（不超过5min）至颗粒半透明（不能太干） （ 现配裂解液） 加入原样本量的裂解液复融，漩涡30s混匀，室温孵育3-5min（漩涡混匀1min或是来回上下颠倒混匀）至蛋白质差不多溶解，太稠，再加适量裂解液 室温下（20°C）12000r/min×2-5min（使蛋白样品澄清，储存剩余的蛋白样品于一干净的Ep管中用于更迟的分析，－80°C保存） 取10ul样本，加入90ul超纯水（10倍稀释） 取10ul 稀释液，加入3.0ml 考马斯G-250比色 入＝595nm，G-250空白调零，每个样本三个平行，记录A值，根据标准曲线算出蛋白浓度 根据上样量确定上样体积，并根据上样体积分装之0.5mlEp管中，冰盒保存，剩余样本－80°C存(上样量/（品浓度×10)上样体积) 二、        溶胀； －20°C取出IPG胶条，室温下恢复常温（10min） －80°C取出样本，恢复液态。Count：（13cm PH3-10 250ul：上样体积＋IPG buffer 1.5ul＋DTT 5ul〔0.02g＋125ul 超纯水现配〕＋裂解液＋溴芬兰 1ul＝250ul） 注：17cm，PH3-10 340ul： IPG buffer 2 ul，DTT 7ul 将溶胀盘（clean）调水平 把样品从左向右缓慢加入（切勿产生气泡） 撕开胶条保护膜，胶面朝下，正极与正极保持一致，缓慢放下，赶走胶下所以气泡 放置1hr（盖上盖子），1hr后加入矿物油（先负极端加到胶条1/3，然后正极加入，混合） 翌日溶胀结束（一般12-14hr） 三、        等电聚焦 1、        从溶胀盘中把胶条用滤纸将矿物油吸干后转入电泳槽中，胶面朝上，胶条阳极端与旁标的数字对齐，在胶条的两端（接触到溶胀部位），放上10uL超纯水湿润的盐桥，夹上夹子（盐桥一定要放正，否则跑出的溴芬兰带会歪掉） 2、        从胶条中间开始加入矿物油，让有流满整个槽子，但不能太满，胶条及胶条所在槽加新油，其他槽加回收油（不能让导线暴露在空气中） 3、        设好程序：17°C 50uA 13cm S1 250V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 8000V 线性 4hr 升压 S4 8000V 快速 40，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 4、        设好程序： S1 500V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 10000V 线性 4hr 升压 S4 10000V 快速 60，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 四、        凝胶电泳 1、        在等电聚焦时，把胶制好，注意不要干胶。 13cm 胶条配方（边加边搅拌） 超纯水 17.7ml 30％丙烯酰胺 25.95ml Tris –碱（PH8.8） 15ml 10％SDS（室温） 600ul 10％AP（现配） 600ul TEMED 24ul 18cm胶条配方（100ml） 超纯水 29.62ml 30％丙烯酰胺 43.27ml Tris –碱（PH8.8） 25ml 10％SDS（室温） 1000ul 10％AP（现配） 1000ul TEMED 40ul 18cm胶条配方（80ml） 超纯水 23.7ml 30％丙烯酰胺 34.62ml Tris –碱（PH8.8） 20ml 10％SDS（室温） 800ul 10％AP（现配） 800ul TEMED 32ul 注意：AP与TEMED同时加入！ 2、        胶条从－20°C转到室温，放10min，同时取出胶条平衡母液（-20°C），室温解冻。 平衡液I：0.1gDTT，10ml平衡母液 平衡液II：0.25g碘乙酰胺，10ml平衡母液 摇床准确平衡15min，配制电泳缓冲液（10×电泳缓冲液 50ml加入双蒸水450ml），快结束时候把胶条转移到另外两个槽，加入平衡液II，还有5min时候溶解琼脂糖，双蒸水系胶3次，侧着架子把水吸干。 3、        平衡结束转移胶条至滤纸，用超纯水冲洗上胶，加Marker （10ul 滤纸）在阴极端，用琼脂糖封胶。 4、        上胶到电泳槽中，继续用琼脂糖封胶，大开冷凝器（10°C）待琼脂糖凝固后，加入电解缓冲液，上盖。 5、 开始电泳，设定电流为5mA/gel，一般30min 后溴芬兰跑出胶条成一条直线，此时加大电流到30mA/gel。（350V，30W，5.5hr） 五、        染色 脱色 1、        夹板中取出凝胶，贴到考马斯亮兰R -250中，切角标记，小号30°，大号45°，切到Marker 的对角。（0.2％考兰＋20％冰醋酸，对倍稀释染色） 2、        振荡2hr，结束回收染液。 3、        结束时换一盆装好月1000ml的双蒸水，漂洗1-2次。 4、        配制脱色液：80ml冰醋酸＋250ml无水乙醇＋ddH2O至1000ml，脱色月50min。 5、        在配置脱色液，月1hr左右摇至背景干净，清晰可见点。 6、        双蒸水终止脱色，最后换双蒸水浸泡，扫描，封上保鲜膜4°C保存。
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