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标题:【讨论分享帖】分享你做蛋白质组学实验的protocol

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
动物组织

操作步骤 一、        处理标本 －80°C 取出标本置于碎冰盒中 加入PMSF30ul，PBS1ml洗涤，共3次，滤纸吸干（重复三次），至上清无红细胞 (开启冷冻离心机预冷) 将组织剪碎后移至匀浆器（高压灭菌）中，加入30ul ,1mol/l PH6.8Tris –碱冰浴中完全匀浆 加入NE5ul，室温下匀浆，室温放置20-30min 最后5分钟，现配裂解液（上样缓冲液I 1ml ，DTT 0.012g ，IPG buffer 5ul ，蛋白酶抑制剂 10ul） 分次加入裂解液，冰浴匀浆 匀浆器低速离心1500r/min ×5min（Wash I－20°C预冷） 吸取匀浆液至1.5mlEP管（4°C，12000r/min×30min） 吸取上清（200ul枪至1.5mlEP管中），记录体积 加入3倍体积的沉淀剂I（precipitating agent I）漩涡混匀，冰上孵育15min 加入3倍体积的沉淀剂II（precipitating agent II）漩涡混匀，12000r/min×5min倒掉上清，滤纸吸弃液体 蛋白颗粒向外，高速离心15-30s，小枪吸掉上清 加入3-4倍于颗粒体积（4oul）的洗剂I（wash reagent I），漩涡混匀，彻底洗涤蛋白颗粒 12000r/min×5min，小枪吸弃液体 加足够聚合蛋白颗粒的超纯水（25ul），不应太多，漩涡混匀 加入－20°C预冷至少1hr的洗剂II1ml（为样本量的10倍，也至少为加水量的10倍） 加入洗剂II辅助剂（wash II additive）5ul，漩涡1min，－20°C孵育30min，每隔10min漩涡一次（20-30s/次） 12000r/min×5min，吸弃液体，瞬时离心15-30s，彻底吸弃洗涤剂室温风干（不超过5min）至颗粒半透明（不能太干） （ 现配裂解液） 加入原样本量的裂解液复融，漩涡30s混匀，室温孵育3-5min（漩涡混匀1min或是来回上下颠倒混匀）至蛋白质差不多溶解，太稠，再加适量裂解液 室温下（20°C）12000r/min×2-5min（使蛋白样品澄清，储存剩余的蛋白样品于一干净的Ep管中用于更迟的分析，－80°C保存） 取10ul样本，加入90ul超纯水（10倍稀释） 取10ul 稀释液，加入3.0ml 考马斯G-250比色 入＝595nm，G-250空白调零，每个样本三个平行，记录A值，根据标准曲线算出蛋白浓度 根据上样量确定上样体积，并根据上样体积分装之0.5mlEp管中，冰盒保存，剩余样本－80°C存(上样量/（品浓度×10)上样体积) 二、        溶胀； －20°C取出IPG胶条，室温下恢复常温（10min） －80°C取出样本，恢复液态。Count：（13cm PH3-10 250ul：上样体积＋IPG buffer 1.5ul＋DTT 5ul〔0.02g＋125ul 超纯水现配〕＋裂解液＋溴芬兰 1ul＝250ul） 注：17cm，PH3-10 340ul： IPG buffer 2 ul，DTT 7ul 将溶胀盘（clean）调水平 把样品从左向右缓慢加入（切勿产生气泡） 撕开胶条保护膜，胶面朝下，正极与正极保持一致，缓慢放下，赶走胶下所以气泡 放置1hr（盖上盖子），1hr后加入矿物油（先负极端加到胶条1/3，然后正极加入，混合） 翌日溶胀结束（一般12-14hr） 三、        等电聚焦 1、        从溶胀盘中把胶条用滤纸将矿物油吸干后转入电泳槽中，胶面朝上，胶条阳极端与旁标的数字对齐，在胶条的两端（接触到溶胀部位），放上10uL超纯水湿润的盐桥，夹上夹子（盐桥一定要放正，否则跑出的溴芬兰带会歪掉） 2、        从胶条中间开始加入矿物油，让有流满整个槽子，但不能太满，胶条及胶条所在槽加新油，其他槽加回收油（不能让导线暴露在空气中） 3、        设好程序：17°C 50uA 13cm S1 250V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 8000V 线性 4hr 升压 S4 8000V 快速 40，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 4、        设好程序： S1 500V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 10000V 线性 4hr 升压 S4 10000V 快速 60，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 四、        凝胶电泳 1、        在等电聚焦时，把胶制好，注意不要干胶。 13cm 胶条配方（边加边搅拌） 超纯水 17.7ml 30％丙烯酰胺 25.95ml Tris –碱（PH8.8） 15ml 10％SDS（室温） 600ul 10％AP（现配） 600ul TEMED 24ul 18cm胶条配方（100ml） 超纯水 29.62ml 30％丙烯酰胺 43.27ml Tris –碱（PH8.8） 25ml 10％SDS（室温） 1000ul 10％AP（现配） 1000ul TEMED 40ul 18cm胶条配方（80ml） 超纯水 23.7ml 30％丙烯酰胺 34.62ml Tris –碱（PH8.8） 20ml 10％SDS（室温） 800ul 10％AP（现配） 800ul TEMED 32ul 注意：AP与TEMED同时加入！ 2、        胶条从－20°C转到室温，放10min，同时取出胶条平衡母液（-20°C），室温解冻。 平衡液I：0.1gDTT，10ml平衡母液 平衡液II：0.25g碘乙酰胺，10ml平衡母液 摇床准确平衡15min，配制电泳缓冲液（10×电泳缓冲液 50ml加入双蒸水450ml），快结束时候把胶条转移到另外两个槽，加入平衡液II，还有5min时候溶解琼脂糖，双蒸水系胶3次，侧着架子把水吸干。 3、        平衡结束转移胶条至滤纸，用超纯水冲洗上胶，加Marker （10ul 滤纸）在阴极端，用琼脂糖封胶。 4、        上胶到电泳槽中，继续用琼脂糖封胶，大开冷凝器（10°C）待琼脂糖凝固后，加入电解缓冲液，上盖。 5、 开始电泳，设定电流为5mA/gel，一般30min 后溴芬兰跑出胶条成一条直线，此时加大电流到30mA/gel。（350V，30W，5.5hr） 五、        染色 脱色 1、        夹板中取出凝胶，贴到考马斯亮兰R -250中，切角标记，小号30°，大号45°，切到Marker 的对角。（0.2％考兰＋20％冰醋酸，对倍稀释染色） 2、        振荡2hr，结束回收染液。 3、        结束时换一盆装好月1000ml的双蒸水，漂洗1-2次。 4、        配制脱色液：80ml冰醋酸＋250ml无水乙醇＋ddH2O至1000ml，脱色月50min。 5、        在配置脱色液，月1hr左右摇至背景干净，清晰可见点。 6、        双蒸水终止脱色，最后换双蒸水浸泡，扫描，封上保鲜膜4°C保存。
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 小中大

2-D做的过程中有很多问题呢，呵呵，大家交流一下问题吧
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 小中大
蛋白浓度测定方法

蛋白浓度测定方法 BCA法测蛋白浓度步骤： 准备工作液（working reagent）：50A:1B和标准品（至少5个） 25ul样品加200ulWR{ 2.5uL稀释10倍（2.5uL+22.5uL）} 震荡30秒 37℃孵箱内孵育30分钟 冷却至室温后测562nm处紫外（使用程序27） Black 0.87s Auto zero 1. stock 2000 2. 八个标准梯度 Folin法测定蛋白含量 1. 用品和仪器：分光光度剂，试管及试管架，微量自动取液仪（20，100，200，1000UL） 2. 试剂：试剂甲：贮液A(4g/100mlNa2CO3),贮液B(0.2mol/100lNaOH),贮液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),贮液D（2g/100ml 酒石酸钾钠）临用前将A和B等体积混合为碳酸钠－氢氧化钠溶液，C与D混合盛Folin-酚试剂甲，一天内有效 试剂乙：取乌酸钠100G，目酸钠25G，置于2000ml膜口回流装置内，加蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10小时（烧瓶中加入玻璃珠以防溶液外溅）再加入硫酸锂150g蒸馏水50ml及液溴数滴，在通风厨开口煮沸15分钟，以除去多余的溴，冷却后定容与1000ml，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，颜色为鲜黄色，置于棕色瓶中，可在冰箱长期保存，颜色变绿，在加几滴溴，煮沸数分钟，恢复原色试剂乙在使用前应该确定其酸度，使之滴定标准氢氧化钠试剂(1mol/l),以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红－紫红－紫灰－墨绿即可为终点，酸度为2MOL/L将其稀释到1mo/l即可标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白3mg溶于双证水中，定容于10ML,浓度为0.3mg/ml 3实验方法：1。取16mm*150mm试管13支，标明号码，放置与试管架，在1－11号试管中分别加入标准牛蛋白血清（0.3mg/ml）0,0.1,0.2--------1.0ml,补足双蒸水至每管体积1.0ml，在12，13管中加入待测样品100UL，并补足双蒸水至1。0ml 3. 加入5.0ml新配置的试剂甲，立即混匀，在室温下放置10分钟 4. 各管中加入0.5ml试剂乙，充分混匀，（用振荡器），然后室温放置30－60min 5. 将标准样及待测样品在可见光光度计上比色，如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色，如果在100ug/ml之内，则在550nm波长下比色 6. 根据已知含量的标准样品测得的光吸收值做标准曲线，然后根据待测样品的光吸收值在标准曲线上查出蛋白含量 酪安酸差色光谱法 1. 打开分光光度剂，预热30分钟，是紫外灯处于稳定发光状态 2. 在2容积为1mlde 微量石英比色杯中分别加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸缓冲液，把盛有PH12.0缓冲液的比色杯放入样品杯中放入支架上，把盛有PH7.4缓冲液的比色杯放入到参比杯的支架上，然后准确的测出295nm波长下的光吸收值，或用250－350nm扫描 3. 在上述的2个比色杯中分别加入100UL的待测样品液，小心振荡混匀 4. 重复2操作 5. 计算蛋白浓度：﹝(PH为12.0A295-PH为7.4A295)/2.330×N﹞×W N是蛋白分子中酪安酸毫摩尔消光系数之差 W是样品稀释倍数 紫外光吸收法测定蛋白浓度 1． 用品和仪器：紫外分光光度剂，微量自动取液仪 2． 试剂：标准蛋白质溶液：准确称重的纯净蛋白质，配成1mg/ml储液置于4度中备用 0.1mol/l磷酸缓冲液，PH7.4;0.1mol/l磷酸缓冲液，PH12.0 3.试验程序： 1，在2个洁净干净的石英比色杯中（内径1cm）中加入蒸馏水或其他用于溶解标准蛋白质与待测样品的缓冲液，其中一个作为参比杯（在以后测量不变），另一个作为样品杯，放入分光光度剂的相应位置 2，记录下空白杯在280260nm处的光吸收值，或对之进行250－350nm波长范围的基线扫描 3，移去样品比色杯中的蒸馏水或是缓冲液，干燥比色杯（用滤纸吸取残液） 4，在样品比色杯中加入待测样品液，在实验中提取样品30ul加入2970ul双证水，混匀，样品液事先通过离心或用0.2um孔径的滤膜过滤 5，重复2步骤 6．蛋白含量计算：蛋白浓度（mg/ml）=1。55A280—0.76A260
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yychen[使用道具]
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 小中大
蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)

蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术) 1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 2 操作过程 SDS-PAGE电泳→转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应 洗涤→显色或化学发光显影 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. 3 注意的问题 （1） 蛋白质电泳 常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。 （2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 （3）封闭 用5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温2h或4ºC过夜 （4）显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定 （5）膜的再利用 化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping －2ME ） Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的 用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交 二、ELISA 1 原理： ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。 ELISA 常用的酶和底物 辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔黄色 ，检测波长492nm TMB， 蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯）, 黄色 检测波长405nm ELISA各步骤的反应时间 包被：24－36h，蛋白浓度为1－5ug/ml 封闭：37ºC 2h 或4ºC过夜（3％BSA） 样本反应时间：37ºC 45min-1h 酶标抗体反应时间： 37ºC 45min-1h 显色时间：15min(避光） 设对照 可以一次包被多块板，冻存备用 2 类型 （1）间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。 (2) 双抗体夹心法测抗原 是检测抗原最常用的方法。 只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。 常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体 单克隆抗体＋单克隆抗体 后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。 用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。 双抗体夹心法测抗原的方法： 捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含0.1％Tween的PBS)→酶标单抗或多抗→洗涤→显色→检测 (3)竞争法测抗原 1）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。 方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ELISA reader检测 2）抗原固相测抗原 其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。 方法: a: 抗原包被96孔板； b:封闭; c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入96孔板 e: 洗涤 f：加入酶标二抗 g：洗涤 h：显色和检测 （4）IgM抗体的检测 1）间接法： 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。
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 小中大
因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。 方法： a: 抗原包被96孔酶标板； b:封闭; c: 待测血清与A蛋白反应一定时间后离心 d: 吸取上清液加入96孔酶标板 e: 洗涤 f：加入酶标抗IgM的抗体 g：洗涤 h：显色和检测 2）捕获包被法（夹心法） 先用抗人IgM抗体包被ELISA板，以捕获血清标本中的IgM（包括针对抗原特异性的IgM和非特异性的IgM)。然后加入相应抗原，继而加入针对抗原特异的酶标抗体，再与底物作用，颜色的深浅即与标本中的IgM含量成正相关。 方法： a: 抗人IgM抗体包被96孔酶标板； b:封闭; c: 加入待测血清； d: 洗涤96孔酶标板 e: 加入相应抗原 f：加入抗原特异的酶标抗体 g：洗涤 h：显色和检测 （5） ABS-ELISA技术 （Avidin Biotin system-ELISA 原理 亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。 操作过程： 抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和检测 三 免疫荧光技术 利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 （一）细胞膜蛋白分子的检测 原理： 细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量 1 直接法：细胞＋荧光素标记的抗CD分子的抗体→4ºC反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析。 2 间接法：细胞＋抗CD分子的抗体→4ºC 反应30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析 悬浮细胞：用PBS洗二次后再做染色 贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色 2 Annexin V检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标) 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 样本处理和染色方法 1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。 2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
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3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 （二）细胞内蛋白分子的检测 细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。 操作过程： （1）直接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和 渗透化→封闭→荧光素标记的抗体→ 洗涤→荧光显微镜观察或流式细胞计分析 （2）间接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和渗透化→封闭→针对蛋白的特异抗体→洗涤→荧光素标记的二抗→洗涤 → 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。 1 悬浮细胞的染色： （1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1×106），PBS洗2次， （2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。 （3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次， （4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。 （5）加入 FITC标记的TFAR19单抗，4°C反应30min （6）荧光细胞洗液洗2次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。 2：贴壁细胞的原位染色 （1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。 （2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。 （3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ul）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。 四免疫组织化学技术 原理： 是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。 免疫组化染色技术的分类 免疫荧光法（Immunofluorescence technique） 免疫酶法（Immunoperoxidase technique） 免疫金银法（（Immunogold technique） ABC法（ Avidin-Biotin Complex） 五 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1 GST融合蛋白进行Pulldow实验 （1）原理 细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 （2）方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4ºC 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS-PAGE电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行 2 免疫共沉淀 （1）原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
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发表于 2012-12-3 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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Saravanan R S, Rose J K C. 2004. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics, 4: 2522-2532. Shen S H, Jing Y X, Kuang T Y. 2003a. Proteomics approach to identify wound-response related proteins from rice leaf sheath. Proteomics, 3: 527-535. Shen S H, Sharma A, Komatsu S. 2003b. Characterization of proteins responsive to Gibberellin in the leaf-sheath of rice Oryza sativa L seedling using proteome analysis. Biol Pharm Bull, 26: 129-136. Chan, Z.L., Qin, G.Z., Xu, X.B., Li, B.Q., and Tian, S.P. 2007. Proteome approach to characterize proteins induced by antagonist yeast and salicylic acid in peach fruit. J. Proteome Res. 6: 1677-1688. 版主有你的这几篇参考文献的原文吗？
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好贴啊，我刚做蛋白不久，暂时没有什么好的protocols，以后有了再跟贴
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bring[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也刚刚开始尝试做2-D蛋白电泳，请问有没有人做微生物菌体蛋白的？
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qqq111[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个主意确实不错，自己的PROTOCOL, 经过实验验证了的就是无价之宝。，可惜我现在还没有跑出好的胶图，等成功了，我也把自己的PROTOCOL 给大家分享
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