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标题:【讨论分享帖】分享你做蛋白质组学实验的protocol

gogo[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主 请问TCA/丙酮是如何配制的，是不是10%TCA，0.07%β-巯基乙醇，丙酮配置
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
忘了告诉楼主，我也在做药用植物蛋白质组，过程中有较多的疑惑，以后再逐一请教！谢谢分享了如此多的经验知识，祝一切顺利！
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birdfish[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
动物组织蛋白提取方法

操作步骤 处理标本 －80°C 取出标本置于碎冰盒中 加入PMSF30ul，PBS1ml洗涤，共3次，滤纸吸干（重复三次），至上清无红细胞 (开启冷冻离心机预冷) 将组织剪碎后移至匀浆器（高压灭菌）中，加入30ul ,1mol/l PH6.8Tris –碱冰浴中完全匀浆 加入NE5ul，室温下匀浆，室温放置20-30min 最后5分钟，现配裂解液（上样缓冲液I 1ml ，DTT 0.012g ，IPG buffer 5ul ，蛋白酶抑制剂 10ul） 分次加入裂解液，冰浴匀浆 匀浆器低速离心1500r/min ×5min（Wash I－20°C预冷） 吸取匀浆液至1.5mlEP管（4°C，12000r/min×30min） 吸取上清（200ul枪至1.5mlEP管中），记录体积 加入3倍体积的沉淀剂I（precipitating agent I）漩涡混匀，冰上孵育15min 加入3倍体积的沉淀剂II（precipitating agent II）漩涡混匀，12000r/min×5min倒掉上清，滤纸吸弃液体蛋白颗粒向外，高速离心15-30s，小枪吸掉上清加入3-4倍于颗粒体积（4oul）的洗剂I（wash reagent I），漩涡混匀，彻底洗涤蛋白颗粒12000r/min×5min，小枪吸弃液体加足够聚合蛋白颗粒的超纯水（25ul），不应太多，漩涡混匀加入－20°C预冷至少1hr的洗剂II1ml（为样本量的10倍，也至少为加水量的10倍）加入洗剂II辅助剂（wash II additive）5ul，漩涡1min，－20°C孵育30min，每隔10min漩涡一次（20-30s/次）12000r/min×5min，吸弃液体，瞬时离心15-30s，彻底吸弃洗涤剂室温风干（不超过5min）至颗粒半透明（不能太干）（ 现配裂解液）加入原样本量的裂解液复融，漩涡30s混匀，室温孵育3-5min（漩涡混匀1min或是来回上下颠倒混匀）至蛋白质差不多溶解，太稠，再加适量裂解液室温下（20°C）12000r/min×2-5min（使蛋白样品澄清，储存剩余的蛋白样品于一干净的Ep管中用于更迟的分析，－80°C保存）取10ul样本，加入90ul超纯水（10倍稀释）取10ul 稀释液，加入3.0ml 考马斯G-250比色入＝595nm，G-250空白调零，每个样本三个平行，记录A值，根据标准曲线算出蛋白浓度根据上样量确定上样体积，并根据上样体积分装之0.5mlEp管中，冰盒保存，剩余样本－80°C存(上样量/（品浓度×10)上样体积)
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人做的是马铃薯蛋白质组学，其块茎蛋白的提取方法一般为：改良三氯乙酸／丙酮沉淀法 根据Görg等（2000）和Hajduch等（2001）的方法稍有改动。其步骤为：取材料约1 g，研磨成细粉末后，按植物材料鲜重1 : 2（w/v）的比例加入蛋白质提取缓冲液2 mL（40 mM Tris-HCl，pH 7.0）。将研碎样品摇匀，并在4 oC条件下放置1 h，充分溶解蛋白质。放置后的样品摇匀，15000 × g离心5 min，上清液同条件下再次离心10 min，收集上清液加入5~10倍体积的预冷丙酮。涡旋振荡后静置于-20 oC，过夜沉淀，12000 × g离心15 min，沉淀重悬于含0.07% β-巯基乙醇的等体积预冷丙酮溶液里（1~2次），12000 × g离心5 min，真空干燥沉淀，得到的粗蛋白质干粉用分析天平进行称重后，-70 oC保存备用，或直接进行下一步提取。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助

请问有做细菌分泌蛋白的吗？能不能介绍下啊？十分感谢~
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发表于 2012-12-3 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

能分享一下植物叶片蛋白提取的方法吗？ PS：植物叶片中的高峰度蛋白如Rubisco会干扰电泳结果吗？需不需要用什么专一性抑制剂除掉啊？
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问能分享一下植物叶片蛋白提取的方法吗？本人刚开始做，中间有很多问题，希望高手能指点一二，非常感谢~~ PS：植物叶片中的高峰度蛋白如Rubisco会干扰电泳结果吗？需要排除干扰吗？应该怎样去除啊？用什么抑制剂比较好？
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-12-3 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问能分享一下植物叶片蛋白提取的方法吗？叶片中的高峰度蛋白如Rubisco需要用专一性抑制剂降低吗？
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-12-3 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Protein Extraction from Drosophila

Protein Extraction from Drosophila Protein extracts were prepared from salivary glands dissected from third instar larvae homogenized in a buffer comprising: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.2% Triton X-100, 0.2% NP40, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1.5 μg/ml aprotinin.
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2012-12-3 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谁有植物膜蛋白的提取方法

七次跨膜蛋白的提取方法谁有？传上来分享下！
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