【分享帖】Transwell侵袭实验总结 - 经验共享

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标题:【分享帖】Transwell侵袭实验总结

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发表于 2012-12-26 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，进行细胞计数。
Fig12

附件

2012-12-26 10:08

53403812.jpg (7.92 KB)

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发表于 2012-12-26 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
肿瘤
第三节 Transwell的其他应用的实验步骤
1．Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤
做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：
(1). 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。
(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。
(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。
(4). 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
(5). 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3750799_1.html')

3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验
我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2681611&sty=3&keywords=Transwell')

4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照)] ×100%.
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=850667&sty=3&keywords=Transwell')

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发表于 2012-12-26 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
肿瘤感染

guxuefeng战友的Transwell应用指南：
1. 混合培养 0.4、3.0µm 细胞/细胞、细胞/物质相互作用、基质与上皮、细胞/基质的相互作用、肿瘤多相性。
2. 趋化性 3.0、5.0、8.0、12.0µm 血液有形成分的趋化性、噬细胞、巨噬细胞的迁移。
3. 药物的转移 0.4、3.0µm 受体定位、药物反应极性、药物作用于血管渗透性、药物通过上皮、内皮细胞、脑血管上皮细胞。
4. Endocytosis 0.4、3.0µm 膜同期、细胞因子、激素、抗体、毒素的受体－配体反应、蛋白质更新。
5. 体外受精 0.4、0.3µm 卵泡粒膜细胞培养、内分泌和旁分泌对卵泡粒膜的影响。
6. 转移与入侵 0.4、8.0、12.0µm
7. 微生物发病 0.4、3.0µm 病毒细菌、寄生虫、吸附宿主血细胞、入侵穿透上皮屏障、微生物受体及其药物作用。
8. 极性 0.4、3.0µm 离子通道、蛋白、酶、酯类、受体的极性、极性发生与维持、紧密连接的合成与集合。
9. 组织模型重建 0.4、3.0µm 伤口愈合、血管发生、上皮再生、感染。
10. 转移/渗透性研究 0.4、3.0µm 大分子、离子、水、小分子、如：激素、生长因子。
原文链接：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1397812&sty=3&keywords=transwell')

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发表于 2012-12-26 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

transwell膜和孔径的选择:
TRANDSWELL透过性支持物可提供三种膜材料 C\PET\胶原包被的PTFE.(膜的特性见附件)
a、PET膜TRANWELL透明嵌入式的特点是带有在显微镜下呈透明的膜。这些膜经过处，可以让细胞更好的贴附和生长。TRANSWELL透明嵌入式使细胞在相差显微镜下更易观察，可以估计细胞的生长状态和单细胞层的形成。
b、聚碳酯TRANWELL嵌入膜提供0.1-12µm的多种孔径。绝大多数经过处理，使得细胞更易贴附。
c、TRANSWELL-COL嵌入膜带有湿润时透明的，胶原包被的PTFE膜，使得细胞更易贴附和伸展，同时在培养的过程中可以观察。TRANSWELL-COL含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合I型和III型胶原，不同于传统包被技术会形成密封的膜层，特殊的技术稳定性的胶原包裹住滤膜的每一根纤维，从而保持了膜的多孔性。
选择孔径：
在实验中使用TRANSWELL透过性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的，
附件2有推荐透过性支持物的常规应用和推荐使用的孔径，最小孔径的TRANSWELL膜（0.1µm）主要应用于药物转动研究。细胞侵袭、趋化性和运动性研究通常采用3.0um或以上的孔径的TRANSWELL膜。细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系与培养条件有关，同时也与孔径相关，小于3.0µm孔径条件下，细胞不会迁徙通过，对于一些要求严格的实验，建议在实验中选择一系列孔径作为对照来确定哪种尺寸最适合于你的细胞培养与特殊应用（当然这个建议成本是很高的，呵呵）。还有一个方法就是参照已经发表的文献的推荐，若需要更多的使用与应用信息，可以到corning的网站技术信息部分的TRANSWELL查阅参考。
原文链接：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=5116572&sty=3&keywords=Transwell')

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发表于 2012-12-26 15:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

protocol
具体步骤：
（1）基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；
（2）取300ul无血清培养基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel ，混匀，（ 4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3个室）；放入37℃培养箱中，孵育4-5h（>5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。
注释：无血清培养基和基质胶按1：5稀释，每孔加50ul，在37℃培养箱中1-2h。
（3）消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；
（4）用无血清培养基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100ul细胞悬液；
（5）下腔室中加入500ul含有20％FBS条件培养基；
（6） 37℃培养箱中，孵育20-24h；
（7）取出transwell用PBS洗2遍， 5%戊二醛固定，4℃；
（8）加入结晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（5－10min），室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。
链接：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/5918815')

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发表于 2012-12-26 15:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Matrigel invasion assays
Overview
Matirgel is considered as basement membrane and generated from EHS sarcoma. Matrigel contains not only basement membrane components (collagens, laminin, and proteoglycans)but also matrix degrading enzymes/their inhibitors and growth factors. Invasion of tumor cells into Matrigel has been used to characterize involvement of ECM receptors and matrix degrading enzymes which play roles in tumor progression.
Material
- Matrigel (Becton-dickinson)
- 24-transwell (Coster)
- Fibronectin(Sigma)
- Diff-Quick staining solution (Fischer Scientific)
Procedure
1. Thaw Matrigel at 4C overnight.
2. Dilute Matrigel (5mg/ml to 1 mg/ml) in serum free-cold cell culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM, etc).
3. Put 100 ul of the diluted matrigel into upper chamber of 24-well transwell
4. Incubate the transwell at 37C at least 4 to 5 h for gelling.
5. Harvest cells from tissue culture flasks by Trypsin/EDTA.
6. Wash the cells 3 times with culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM etc)containing 1 % FBS.
7. Resuspend the cells in media containing 1% FBS at a density of 10^6 cells/ml.
8. Gently wash gelled matrigel with warmed serum free-culture media.
9. Put 100 ul of the cell suspension onto the matrigel.
10. lower chamber of the transwell is filled with 600 ul of culture media containing 5 ug/ml fibronectin, as an adhesive subtrate.
11. Incubate at 37C for 20 to 24 h.
12. Remove transwells from 24-well plates and stained with Diff-Quick solution.
13. Scrape off noninvaded cells on the top of the transwell with a cotton swab.
14. Count invaded cells under a light microscope.

Troubleshooting
- Need to check batch of matrigel.
- Matrigel tends to form gel very quickly at room temerature, therefore, pipets and tips using in steps 2 and 3 have to be chilled at -20C prior to experiements.
- In our experience, matrigel would not make gel under a concentration of 1 mg/ml.
- If cell make aggregation during invasion assays, reduce the density of cell suspension (at step 7).
- Invasion assays can be performed for 36 to 40h.

Reference
Knutson, JR., Iida, J., Fields, GB, and McCarthy, JB.
Molecular Biology of the Cell, 7: 383-396, 1996.
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=850832&sty=3&keywords=Transwell')

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发表于 2012-12-26 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Thincert做侵袭实验的步骤
下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤（摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert™ cell culture inserts》，大家如需要，可用google搜之）：
1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures
2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA
3. Harvest cells and wash them twice in PBS
4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml)
5. Place 24 well ThinCertTM cell culture inserts in the wells of a CELLSTAR® 24 well cell culture plate
6. Add 600 µl culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate
7. Add 200 µl cell suspension to each cell culture insert
8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2
9. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 µl serum-free culture medium with 8 µM Calcein-AM
10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2
11. Remove the culture medium from the cell culture inserts
12. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 µl prewarmed Trypsin-EDTA per well
13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2, agitate the plate from time to time
14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 µl of the Trypsin-EDTA solution (now containing the migratory cells) from each well into a black flat bottom 96 well plate
15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7459761&sty=3&keywords=Thincert')

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发表于 2012-12-26 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

下面这些帖子也很有价值，就不一一复制过来了，大家自己去看看

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=5872538&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=2932571&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4530205_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7148557&sty=1&tpg=1&age=0')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/7453397')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6922815')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6927598')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4330371_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2875154&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2681611&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=4823507&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2882062_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3655749&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3643925_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2783181&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4314590&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4409970&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=1647043&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=6417462&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4528099_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=6320167&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1846597&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3015023_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7501496&sty=1&tpg=2&age=0')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=6030643&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7427307&sty=3')

另外推荐两本书：韩锐主编的《抗癌药物研究与实验技术》和司徒镇强《细胞培养》，都有相关讲解。

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请问有没有知道 BD公司的Matrigel保质期有多长时间？(-20度保存）说明书上只说stable for a minimum of 3 months from day of shipment when stored at -20℃.我有-20℃存放两年的Matrigel(师姐留下来的）现在还能用吗？

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小中大

关心中，也有过期半年左右的Matrigel，不知道还能不能用，希望有经验的战友解答一下！

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