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标题:【求助】用过transwell或养过Caco-2细胞的请进

biabiade[使用道具]
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发表于 2012-12-27 20:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】用过transwell或养过Caco-2细胞的请进

我养Caco-2细胞,现在已经接种到6孔培养板的插入式小室(即在6孔培养板的每个孔中再加单独的小室,transwell,让Caco-2细胞长在小室的膜上),目前存在的问题是:1.细胞接种不均匀,我已在园内搜索了一些接种技巧,按照那些方法不是很有效,细胞全部集中在中间;2.细胞换液后,原来贴壁的细胞都脱落了,连在一起,用肉眼可见细胞培养液中有白色漂浮物,估计是死细胞,我以为是换液动作太粗鲁了,再换液时又加倍小心,可是那些漂浮物依然存在,不能通过换液除去;3.文献说Caco-2细胞在膜上长5-7天就可以长满,可是7天了,镜下观察,依然是中间有细胞,周围很少,怎么回事呢?有明白的高手请指点一下吧,不胜感激!
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发表于 2012-12-27 20:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目前我也在做这个试验，对你的问题进行讨论，共同学习。
问题一的解决：提高细胞密度，5次方以上，用移液枪均匀滴加植入millicell中即可。
问题二三：Caco-2细胞生长一定密度和时间，细胞间形成紧密连接以及细胞表面分化出微绒毛，换液不小心会导致块状脱落或被吸出，可以在每次换液时，只换部分培养液解决。对于你提到白色漂浮物，我想这可能是细胞分泌或分化过程有关。
另外，我观察了24孔培养板中培养1～30天的Caco-2，1～3天细胞间无边界、块状生长，4天后，视接种细胞密度情况，基本可以形成紧密连接。
备注：如在南京，可以面谈。细胞生长照片等整理好可以上传。
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biabiade[使用道具]
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发表于 2012-12-27 20:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，我在北京，离你太远了。问一下，你是用密里博的插入式小室，即millicell么？我怀疑他们的膜不利于细胞贴壁。我的细胞接种到膜上已经一周了，但在倒置显微镜下，我只能看到中间有零星的细胞，观察不到成片的形态（不象培养瓶中形态）。如果说细胞密度少（3*105也不少了），但每隔一天换液时，培养液明显变黄，而且我还测电阻了，电阻值一直在增加，这是怎么回事呢？难道我一直没找到细胞？每次移动培养板时，可以看到有很多细胞在动，似乎细胞没有贴壁，如果是死细胞换液后就应该没有了，但换液后这些东西还在，难道是分化的微绒毛？真痛苦啊！你有没有长在膜上的Caco-2细胞形态啊！如能指点一二，万分感谢！
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发表于 2012-12-27 20:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
膜上的细胞是观察不到的
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biabiade[使用道具]
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发表于 2012-12-27 20:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

啊，是么?在倒置显微镜下观察不到细胞单层么？但是有的文献说21天后可以观察到膜上细胞的形态，怎么回事呢？是不是我养的时间短所以观察不到细胞啊！问另外一个问题，你测电阻么？我的细胞在接种后的第8天电阻为（241-143）*4.2=411.6，计算公式：（有细胞电阻值-无细胞空白电阻值）*六孔板膜面积，文献上说电阻大于250表明细胞即可使用，那岂不是我现在就可以开始吸收试验了？但不是21天才能形成单层么？能帮我解释以下么？谢谢！
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-12-27 20:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在倒置显微镜下是不是能观察到细胞，要看你使用的transwell是什么材料的，如果买的是聚碳酯的只能染色后观察，如果买的是透明聚酯膜就可以直接观察了
纹鹿你在北京哪个单位，我也正在做Caco－2相关试验，可以交流一下吗？
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发表于 2012-12-27 20:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也正在做这个实验，我在往膜上种细胞后，与你的现象正相反，中间有一个缺口，边上的细胞到练成一片。不知道是不是细胞种的不匀。还是没有长融合，或者是被细菌破坏了，在显微镜下是看不到细胞的，所以各种因素都不能确定，我种的密度是5次方，也不行，很郁闷。我在天津
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发表于 2012-12-27 20:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过的，不过也不是什么高手，应该是要测膜电位来确定是否单层完全融合吧，换液的时候一定要轻，不能够碰到下面的，说时候transwell也实在说太贵了，一个那么小的孔就是30快钱，还是一次性的。
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发表于 2012-12-27 20:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好！
高兴看到这个帖子。请问：药物也要做倍比稀释吗？
有没有统一的阳性对照？结果怎么分析呢?

还有，我现在培养瓶里的细胞3天就可以基本长满，
为什么millicell要21天呢？
非常感谢，！！
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bohe221[使用道具]
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发表于 2012-12-27 20:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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