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标题:【讨论帖】western blot问题解答

bs4665[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是新手
最近跟着师兄在做
上周一直都很顺利
这周同样的样本和试剂,只是二抗的量有微调.
不知道为什么就是没有结果,只有内参的条带能出来,另外的目的蛋白完全不显
请教大概会是什么原因呢？
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发表于 2013-2-8 09:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我想问您几个问题：
我做的是单核细胞株上的TLR4蛋白表达，分子量90KD，转膜用的是70V湿转2小时，10%牛奶封闭过夜，一抗1：500孵育3小时，二抗1：5000孵育1小时，然后洗膜发光，但是TLR4基本上没有显影，但是内参很浓很明显，之前也是这个条件做出来过，但是今天不知道为什么做不出来了，请求指导！谢谢您。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教我的目的蛋白是59kd和38kd。我转膜势400mA,转膜60分钟，但是转过了头（我分别进行考马斯亮蓝和丽春红染色）。以前我们也是这样的条件，但是转膜恰好，这是什么原因呢？你看以上的目标蛋白改用多大的电流和时间呢？我的膜是NC膜，谢谢！
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发表于 2013-2-8 09:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，您好！
我最近做western遇到一些问题向您请教下。抗体是cell signal的，第一次做的时候一抗按照1：2000稀释，二抗1：2000稀释，蛋白上样量15ug，没有杂出任何条带，考虑可能一抗浓度不够，第二次把一抗的浓度调整为1：1000，蛋白上样量30ug，因为是连续做的，所以接着用了前面的抗体，把浓度调整了一下，还是什么都没有杂出来，第三次考虑二抗的浓度过高消耗了ECL底物，把二抗浓度调整为1：4000，上样量40ug，还是什么都没出现，此外第二次actin出现了一次，第三次actin用的半个月以前配的杂出来了，新近配的没杂出来，请问楼主是什么原因呢？
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发表于 2013-2-8 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主好：我做130kd的蛋白，8%的胶。转膜液体10%甲醇，千分之一SDS。300ma 1个半小时。转膜完成后发现marker在膜上不明显 无法切膜。奇怪的是比较小的marker都能看到，反而是70多的红色marker非常模糊.请您分析一下是什么原因。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
4度一年没问题
你调整一下后先染胶
把结果图放山来

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恩，谢谢老师，找到原因了，是电泳缓冲液的问题，重新配了一批，现在已经正常了。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主好，看了你众多的问题解答，觉得收益匪浅！感谢！
最近开始做WB，一个月前学习这门技术时只做内参蛋白GAPDH，条带每次都很好，正式开始做目的蛋白了，结果却没有很迷惘！我开始给自己找原因 ：
1，因为粗心，电转液新配制时忘记加甲醇了，可是考马斯亮蓝染色证实蛋白都转到膜上了，是否没有加甲醇会对结果有很重要的影响？？
2. 换了一瓶新的ECL显色液，想证实一下显色液是否有问题，我看论坛上提到在NC膜上点杂交的办法，实验室没有NC膜，请问PVDF膜可以用来检测二抗，及ECL显色液是否有问题？？怎么检测，能否告知具体方法？？非常感谢！！
3，同一瓶电转缓冲液储存液前后两次配制的电转液，一次电流达到350MA，一次电压达到100V，分别是按恒流及恒压电转的，所以很奇怪？？电转仪器用的是BIO-RAD的装置！
楼主可否给予一定的建议和意见！
蛋白我认为是没有问题，冰上孵育我都很注意！考马斯亮蓝染色证实蛋白是存在的！可是结果不知怎么解释？？希望楼主帮帮我！
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 小中大
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不知道为什么就是没有结果,只有内参的条带能出来,另外的目的蛋白完全不显
请教大概会是什么原因呢？

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样品冻融了几次？
感觉是样品冻融
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发表于 2013-2-8 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我想问您几个问题：
我做的是单核细胞株上的TLR4蛋白表达，分子量90KD，转膜用的是70V湿转2小时，10%牛奶封闭过夜，一抗1：500孵育3小时，二抗1：5000孵育1小时，然后洗膜发光，但是TLR4基本上没有显影，但是内参很浓很明显，之前也是这个条件做出来过，但是今天不知道为什么做不出来了，请求指导！谢谢您。

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是同样的样品吗？
考虑一下样品降解
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 小中大
请教我的目的蛋白是59kd和38kd。我转膜势400mA,转膜60分钟，但是转过了头（我分别进行考马斯亮蓝和丽春红染色）。以前我们也是这样的条件，但是转膜恰好，这是什么原因呢？你看以上的目标蛋白改用多大的电流和时间呢？我的膜是NC膜，谢谢！

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300mA 60min就够了
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