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标题:【讨论帖】western blot问题解答

xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
B-ACTIN不齐一定是测蛋白浓度引起的吗？我今天做了一个5组的组织蛋白，1，2组ACTIN很粗，3，4，5较细但这三组比较齐，不知是什么原因，请帮我回答一下吧？谢谢！
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发表于 2013-2-8 09:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我目的蛋白大概40kD，内参为B-Tubulin 55kD，想在一张膜上把这两个蛋白抗体都结合上去，请问：我是应该先孵育一种抗体，洗涤，再孵育另一种抗体，洗涤，上二抗；还是把两种蛋白抗体混合在一起孵育，洗涤，再上二抗？两种抗体之间会不会互相影响？谢谢！

=======================================================

如果你的分离效果好，最好是在40-55之间的位置把膜剪开，各做各的；
如果不好剪，那你就先做目标蛋白，目标蛋白出来后在做内参。
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发表于 2013-2-8 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在正在做一个非磷酸化蛋白的Wb，蛋白分子量是80KD，这个蛋白有磷酸化和非磷酸化两种状态，非磷酸化状态时在胞核，磷酸化时在胞浆，之前提的冰冻组织的总蛋白，裂解液用的是碧云天的，上样量加到了150微克，一抗稀释浓度为1比100都没怎么做出来，请问我这种情况需要提取核蛋白做吗？

有没有一些好的建议，提示一二，感激不尽啊

谢谢谢谢谢谢谢~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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发表于 2013-2-8 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我目的蛋白大概40kD，内参为B-Tubulin 55kD，想在一张膜上把这两个蛋白抗体都结合上去，请问：我是应该先孵育一种抗体，洗涤，再孵育另一种抗体，洗涤，上二抗；还是把两种蛋白抗体混合在一起孵育，洗涤，再上二抗？两种抗体之间会不会互相影响？谢谢！

==========================================================================================

可以啊
第一：先杂交目的蛋白，加二抗、曝光、用缓冲液洗去ECL，加入内参一抗、二抗、曝光
第二：先杂交目的蛋白，加二抗、曝光，然后用stripping buffer洗去目的蛋白的一抗与二抗，然后封闭，杂交内参
good luck
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发表于 2013-2-8 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教版主：

我现在正在做一个非磷酸化蛋白的Wb，蛋白分子量是80KD，这个蛋白有磷酸化和非磷酸化两种状态，非磷酸化状态时在胞核，磷酸化时在胞浆，之前提的冰冻组织的总蛋白，裂解液用的是碧云天的，上样量加到了150微克，一抗稀释浓度为1比100都没怎么做出来，请问我这种情况需要提取核蛋白做吗？

有没有一些好的建议，提示一二，感激不尽啊

=======================================================

1，什么蛋白？抗体用的是什么厂家的？货号多少？不方便说可以pm我
2，提取的方法是什么？详细点说
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发表于 2013-2-8 09:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
B-ACTIN不齐一定是测蛋白浓度引起的吗？我今天做了一个5组的组织蛋白，1，2组ACTIN很粗，3，4，5较细但这三组比较齐，不知是什么原因，请帮我回答一下吧？谢谢！

==================================================

测定蛋白浓度、调整蛋白浓度、上样、转膜、抗体孵育都会引起
你自己可以想一想
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发表于 2013-2-8 09:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你的分离效果好，最好是在40-55之间的位置把膜剪开，各做各的；
如果不好剪，那你就先做目标蛋白，目标蛋白出来后在做内参。

======================

我的做法是用大的电泳槽
分离胶在10cm左右
充分分离
剪开做
呵呵
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发表于 2013-2-8 09:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
阳萎心肌梗死
试验中又发现一些小问题，想请教一下。
1.现在天气热，27度空调房里，分离胶几分钟就凝了，减少APS和EDMET的量，20分钟左右凝好，积层胶30多分钟凝好。想问一般时间控制在多少好。我现在12%的胶上样后，积层胶还好，基本可成一条线，压线后进入分离胶就变得很散，跑到最后时，最下面溴酚蓝的带很宽，大约0.8cm,我以前跑胶时基本都很漂亮的一条线。请问这是什么造成的，会不会影响结果（个人感觉蛋白带被拉长拉细了），是不是胶凝得不好的缘故？
2.转膜，半干转，15V 45min，小点分子量的预览Mark已经转过到滤纸上了，但72KD的在胶上还可以看到残留，染胶有蛋白带残留，条带稍模糊，也很细。请教，我要不要改善转膜条件呢？是降低电压延长时间还是怎样呢？
谢谢
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-2-8 09:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
大动脉炎
另外，用santa cruz的一抗，1：150稀释，4°过夜，相应二抗室温1h，最后DAB染色，没看到目标蛋白带，也没有背景，完全白板，是什么原因呢？同样条件的内参有条带，但也不强。蛋白应该在膜上，转后用丽春红染过。上样的蛋白量也有100ug了。
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 小中大
想求问，蜡块能否进行western blot？效果会不会受很大影响？
蜡块是上一届师兄留下来的，大约是2-4月份做的，保存在-80度下
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