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标题:【讨论帖】western blot问题解答

zwsyrt[使用道具]
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目的蛋白是IKK-β,actin是当时做的时候取了2ul溶在了5%的BSA4ml中,按1:2000稀释的,我们是丽春红染色后把膜剪开了,actin和目的蛋白分开杂的
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半干还是湿转?
如果是半干的话有可能是滤纸、膜、胶、滤纸短路了
要是湿转的话不存在短路问题

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谢谢老师指导
我们是半转干,那可能是短路了 如果是短路的话在重新做没问题吧 转印槽没事吧 只要重新跑下电泳切胶就可以了吧
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plaa[使用道具]
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大动脉炎阳萎
恩,谢谢NBA师兄!我现在每天都在做WB,但是始终是找不到最佳的一抗二抗稀释比例,我用的是DAB显色法,一抗的话试过1:500,1:1000的,二抗试过1:2000,1:4000的!一抗是santa的,二抗是ZYMED实验室的,我的上样量是25微升,大概40微克的样子,电泳液转移液都是新鲜配置的,转膜之后用立春红染色条带很清晰,但是DAB显色就是看不清,我师姐用了1:500一抗,二抗和我用的不一样,也做出来了。我的封闭时间是2个小时,TBST洗涤时间是接近45分钟,洗涤和封闭时间延长应该只有好处没有坏处吧?一抗二抗为什么不是越浓越好阿,虽然可能会有非特异的条带,但是好歹算看得见吧?谢谢,希望师兄看到的话早点回哦,谢谢!
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66小飞侠[使用道具]
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心肌梗死
目的蛋白100-130KD 5%浓缩胶 8%分离胶。转膜液20%甲醇,千分之一SDS。恒流300ma 1h20min.
发现内参出现2到3条带。蛋白样品是新制的。原来做17的从来没出现过这种情况。请楼主分析一下原因。已经重复两次了,内参都是这样的。膜是新买的0.45的PVDF。
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DNA[使用道具]
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请教一下,干转,电压调到25v,结果只上到16v就不增加了,为什么
转膜分子量62KD,干转,一小时十分钟可以吗
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66+77[使用道具]
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我用的六一的电泳仪DYY-7C湿转,六一的DYCZ-24DNmini型电转移,我的目的蛋白是35-38kd,请问我电转需要多久
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NBA[使用道具]
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相关疾病:
心肌梗死

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NBA老师,试验中又发现一些小问题,想请教一下。
1.现在天气热,27度空调房里,分离胶几分钟就凝了,减少APS和EDMET的量,20分钟左右凝好,积层胶30多分钟凝好。想问一般时间控制在多少好。我现在12%的胶上样后,积层胶还好,基本可成一条线,压线后进入分离胶就变得很散,跑到最后时,最下面溴酚蓝的带很宽,大约0.8cm,我以前跑胶时基本都很漂亮的一条线。请问这是什么造成的,会不会影响结果(个人感觉蛋白带被拉长拉细了),是不是胶凝得不好的缘故?
2.转膜,半干转,15V 45min,小点分子量的预览Mark已经转过到滤纸上了,但72KD的在胶上还可以看到残留,染胶有蛋白带残留,条带稍模糊,也很细。请教,我要不要改善转膜条件呢?是降低电压延长时间还是怎样呢?
谢谢

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1,分离胶20min左右可以啊,40min到1h凝好为佳
2,浓缩胶我一般是12min
3,溴酚蓝会跑的很宽,胶浓度为15%溴酚蓝不会散
4,转膜电压的没有经验,我用恒流,70K的蛋白我选择1.2mA每平方厘米膜面积,时间 1h10min左右
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tuuu2[使用道具]
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另外,用santa cruz的一抗,1:150稀释,4°过夜,相应二抗室温1h,最后DAB染色,没看到目标蛋白带,也没有背景,完全白板,是什么原因呢?同样条件的内参有条带,但也不强。蛋白应该在膜上,转后用丽春红染过。上样的蛋白量也有100ug了。

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转膜不充分
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tuuu2[使用道具]
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想求问,蜡块能否进行western blot?效果会不会受很大影响?
蜡块是上一届师兄留下来的,大约是2-4月份做的,保存在-80度下

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原则上来说应该可以吧
我没做过
做蜡块要把蜡先脱掉
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tuuu2[使用道具]
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目的蛋白是IKK-β,actin是当时做的时候取了2ul溶在了5%的BSA4ml中,按1:2000稀释的,我们是丽春红染色后把膜剪开了,actin和目的蛋白分开杂的

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可以啊
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