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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-19 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您提到的检测二抗的稀释度，用的是新NC膜吗？并不是转过了蛋白的那个膜是吧，在一个膜上同时进行几个点杂交？谢谢啊

====================================

用点杂交
新的NC膜
一张膜上可以进行多个稀释度的检测
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发表于 2013-1-19 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从条带来看你的电泳跑的不好
分离胶没有凝好
二抗用1：20000
你用什么ecl？

=======================================================================================================

谢谢，在国外试验室，用的fisher的ECL，估计是TEMED没有完全混匀，搞的分离胶没有凝好。而且这个p53的一抗，是刚买的，周一order，周二就来了，所以效力可能太强了。说明书上推荐的一抗稀释度是1:100到1:1000，我已经用到1：1000了，那这个一抗是不是还可以再稀释一下啊。再就是连marker也显出条带来了，是一抗浓度高还是二抗浓度高的原因啊？谢谢高手回复，万分感激！
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发表于 2013-1-19 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，在国外试验室，用的fisher的ECL，估计是TEMED没有完全混匀，搞的分离胶没有凝好。而且这个p53的一抗，是刚买的，周一order，周二就来了，所以效力可能太强了。说明书上推荐的一抗稀释度是1:100到1:1000，我已经用到1：1000了，那这个一抗是不是还可以再稀释一下啊。再就是连marker也显出条带来了，是一抗浓度高还是二抗浓度高的原因啊？谢谢高手回复，万分感激！

==========================

Marker也是蛋白
有时候就是能显出条带来的
一抗可以1：2000，1：4000
二抗稀释10倍以上
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发表于 2013-1-19 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我做120kd的CD133，上样100ug总蛋白，1抗用santa的，浓度用到了1：25，跑出这样的多条条带，而且最黑的那条分子量也不太对。是不是因为抗体的质量不好？
CD133为糖基化的膜蛋白，是不是，煮沸对其有影响？
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发表于 2013-1-19 12:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我做120kd的CD133，上样100ug总蛋白，1抗用santa的，浓度用到了1：25，跑出这样的多条条带，而且最黑的那条分子量也不太对。是不是因为抗体的质量不好？
CD133为糖基化的膜蛋白，是不是，煮沸对其有影响？

========================================================

糖基化蛋白有拖尾现象
一抗浓度可以调高一些
用1：100 4度孵育过夜
另外调整条件后仍有非特异性带只能说明抗体的特异性比较差了
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发表于 2013-1-19 12:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好！我现在用western做分子量170KD左右的蛋白，电泳条件：100V，150V。转膜条件：100V，2h。染膜后，完全看不到条带，连marker也没了。
我有几个问题：
1.对高分子量的蛋白来说，是低电压比较合适吗？我的电压过高吧？那多少合适呢？
2.转膜条件太强了吗，转过了？我看到过别人说这样的条件可以啊。
3.以前按这种条件做下来，冲片子出来条带贴别弥散，而且很浅很难看。是跑胶时的问题吗？
谢谢楼主！
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发表于 2013-1-19 12:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wu11998866 于 2013-1-19 12:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主你好！我现在用western做分子量170KD左右的蛋白，电泳条件：100V，150V。转膜条件：100V，2h。染膜后，完全看不到条带，连marker也没了。
我有几个问题：
1.对高分子量的蛋白来说，是低电压比较合适吗？我的电压过高吧？那多少合适呢？
2. ...

对于170K的蛋白来说转膜条件一点都不强
我都用恒流，170K的话 300mA 2h
条带弥散与盐浓度、胶凝固的好坏有关
还有就是Acr与Bis-的比例
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dream2013[使用道具]
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发表于 2013-1-19 12:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这里真热闹，我也有问题

1请问一抗和二抗的浓度怎么确定，请说的详细点
2我做western时，曝光后可以看出pvdf膜上有蛋白质条带，但确暴不出来（用同一批样品做过，可以曝出条带；我用的是酪氨酸磷酸化抗体，可以杂出十几kd，四十多kd，九十多kd，100多kd。）
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发表于 2013-1-19 12:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dream2013 于 2013-1-19 12:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这里真热闹，我也有问题

1请问一抗和二抗的浓度怎么确定，请说的详细点
2我做western时，曝光后可以看出pvdf膜上有蛋白质条带，但确暴不出来（用同一批样品做过，可以曝出条带；我用的是酪氨酸磷酸化抗体，可以杂出十几kd，四十多kd， ...

首先确定二抗的稀释度
然后用不同的一抗稀释度来做预实验（因为二抗浓度已经确定，这会就不需要调整二抗浓度了）
另外你说的爆不出条带是什么意思
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发表于 2013-1-19 12:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主，曝光的结果条带之间都成一条直线，中间没有间隔。是什么原因啊！内参也是一条直线！
先谢谢楼主帮忙解答！
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