蛋白质与蛋白组学

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六一的电泳仪DYY-7C，电泳用的是北京六一DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪(槽)（小号），湿转仪型号为北京六一的DYCZ-40D迷你型转移槽，我的目的蛋白为35-38kd，我的目的蛋白表达量很低，现在上样达到100ug，目的蛋白有的时候出现条带，有的时候曝光没有出现条带，我现在用PVDF膜（0.22），我的转膜时间是多少，是不是300ma转膜40分钟吗？可以延长时间让更多的蛋白转到膜上吗
期待您的答复
提前谢谢您

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300mA 40min够了
在mini胶中上样量100ug已经很大了
你上样100ug的时候染过胶吗？（在没有转膜前）

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其实我也想用枪头加，一般我是把2块玻璃板卡好后往两板中间加电泳液加满，再用微量加样器加样。用枪头加的话是不是不能把电泳液加满啊？也就是说加样口不能和缓冲液页面持平？

实验室4度离心机坏了，离心能用别的办法把温度控制在4度么？

裂解后12000RPM 15MIN左右是不是时间长了啊？还是和细胞数有关？我今天只离了五分钟。
这几天试试了5X106细胞提下蛋白，一般是2-3UG/UL，不知道行不？

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1，我是加满了之后上样的，在你的sample buffer中有甘油，样品会很快沉底的
2，控制在4度我没有好办法
3，4度离心我一般是15到20min
4，细胞蛋白浓度一般就是你说的这个样子，当然行了

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我是新手，假期准备做WB，想请教几个问题。我准备测的蛋白有 细胞色素C、Caspase3和PARP，是做诱导肿瘤细胞凋亡的，湿转，BIO RAD Mini-PROTEAN 3 电泳系统。我想知道这些蛋白的转膜条件和注意事项，我还需要告诉大家什么信息？谢谢各位！

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你说的这几个我都做过
要注意蛋白提取
PARP-1，定位在细胞核，所以你要提取核蛋白来做（这个蛋白在胞浆中很少，可能检不出来，要注意）
caspase3定位在胞浆，要用胞浆蛋白来做
cytochrome C定位在mitochondrial matrix
祝你好运

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谢谢fang版主悉心指导，最近关于western 也是在边做边摸索，我看到网上说如果做的是磷酸化蛋白，在提取组织蛋白的时候需要使用含磷酸酶抑制剂的裂解液配方才可以，我在网上自行搜索了一下，说含有PMSF的裂解液就可以达到要求，我现在使用的是从试剂公司订购的RIPA裂解液（含PMSF浓度为1mM）我查了下RIPA的配方，里面没有抑制磷酸酶常用的钒酸钠，能达到阻止去磷酸化的效果么？
问题2：我看到很多人在讲做western时提到一个名词叫做杂交，是什么含义呢？我在园里搜索看到得回答说western杂交就是western blot，这种说法对么？
问题3：我下一步要做一抗孵育，要检的蛋白有两个，那这两个蛋白的一抗可否配成1份溶液（5%蛋白血清的TBST）同时进行孵育呢？因这两个1抗都是兔抗体IGg，我是不是只要用抗兔IGg的2抗就可以将2个蛋白的2抗同时完成了？

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1，我认为不妥，PMSF在水溶液中全部降解是30min，你买的RIPA中有PMSF，应该全部降解了
建议你买磷酸酶的cocktail，我一直在用Roche的，很好
2，这个你不用太在意，有叫做Western blot，western blotting，immunoblot
3，不可以

谢谢版主悉心指导，最近关于western 也是在边做边摸索，我看到网上说如果做的是磷酸化蛋白，在提取组织蛋白的时候需要使用含磷酸酶抑制剂的裂解液配方才可以，我在网上自行搜索了一下，说含有PMSF的裂解液就可以达到要求，我现在使用的是从试剂公司订购的RIPA裂解液（含PMSF浓度为1mM）我查了下RIPA的配方，里面没有抑制磷酸酶常用的钒酸钠，能达到阻止去磷酸化的效果么？
问题2：我看到很多人在讲做western时提到一个名词叫做杂交，是什么含义呢？我在园里搜索看到得回答说western杂交就是western blot，这种说法对么？
问题3：我下一步要做一抗孵育，要检的蛋白有两个，那这两个蛋白的一抗可否配成1份溶液（5%蛋白血清的TBST）同时进行孵育呢？因这两个1抗都是兔抗体IGg，我是不是只要用抗兔IGg的2抗就可以将2个蛋白的2抗同时完成了？

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3，会有交叉反应
不建议你采用

近来做WB，蛋白为7次跨膜蛋白，分子量220KD，一直采用胰酶消化法将细胞消化完了放-70度，三五天后集齐几个细胞一起做，但老是做不出很明显的条带（内参比较明显，而目的则经常是隐隐约约看不清楚），看了文献该蛋白的WB条带都还可以，不至于含量很低。起初用全蛋白提取试剂盒，后来改用进口的膜蛋白提取试剂盒还是没有改善。现在做不出来明显条带考虑会不会是消化时胰蛋白酶使细胞膜上的跨膜蛋白降解导致目的条带弱？或者方兄对我这个问题有何改进良方？多谢！！！

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如果目的蛋白现在已经有隐约的条带的话
其他的不用改
建议你用更加灵敏的ECL

近来做WB，蛋白为7次跨膜蛋白，分子量220KD，一直采用胰酶消化法将细胞消化完了放-70度，三五天后集齐几个细胞一起做，但老是做不出很明显的条带（内参比较明显，而目的则经常是隐隐约约看不清楚），看了文献该蛋白的WB条带都还可以，不至于含量很低。起初用全蛋白提取试剂盒，后来改用进口的膜蛋白提取试剂盒还是没有改善。现在做不出来明显条带考虑会不会是消化时胰蛋白酶使细胞膜上的跨膜蛋白降解导致目的条带弱？或者方兄对我这个问题有何改进良方？多谢！！！

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胰蛋白酶使细胞膜上的跨膜蛋白降解导致目的条带弱？
你说的这个问题很好
我以前没考虑过
我认为胰酶消化会损失一部分
贴壁细胞你可以直接加裂解液提取蛋白的

请问：配制好的APS在4度和-20度能放多久？有的说4度放2周就开始降解，是吗？降解了对结果有什么样的影响？

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4度2周重配
-20度可以保存半年
降解了对结果有很大影响
胶不会聚合

我也有个问题想问你：
最近看了WB注意事项。
其中，很多教程里都写了这么一句话，
转膜时，滤纸的大小要小于膜的大小。
其目的是为了防止边缘滤纸接触，导致短路！
请问，滤纸接触就能导致短路吗？为什么？
如果上面命题成立的话，那么正负极之间的海绵接触不早就短路了吗
还是滤纸导电性大过缓冲液？
滤纸接触真的会导致转膜不成功吗？如果这样海绵之间是不是也需要铺满转移膜？

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在半干转中滤纸上的缓冲液，起电极作用（及支持作用）
在湿转中滤纸只起支持作用，不会短路