蛋白质与蛋白组学

我得实验室首先构建原核表达，将我要的蛋白序列装到表达载体pGEX-4T1中，我大概算了一下，载体表达蛋白GST ,26kd .我的目的蛋白是11kd .将装有目的蛋白的重组质粒转入BL21 表达菌。挑斑诱导30度，6小时，跑蛋白胶，同时以BL21，pGEX-4T1未诱导与诱导作为对照，在37KD左右可以明显看到蛋白表达。故采用此条件大量诱导，超声提取融合蛋白。上GST珠子，用gsh 洗脱液洗脱。将洗下的蛋白进行透析纯化，进行定量以及电泳检测。采用1mg/ml与佐剂混匀注射兔子。定期采血清。ELISA检测抗体效价，当效价为1/10000时采血。取血清。
采用细菌蛋白跑western ，用抗血清1：1000可以看到明显的目的条带。由于我的基因是x物种，故想用抗血清来检测x 物种中组织中该基因是否有表达。但是组织蛋白我上了30ug 60ug 均未发现目的条带，为什么？原因出在哪？

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组织中目的蛋白11KD，不太好做
可能在你的WB系统上有问题
另外你用细菌蛋白做WB的时候抗体应该会识别两个蛋白：GST与你的目的蛋白
但是你做组织的时候情况就会不一样了

我最近（09年6月份）刚买的抗体上面的Ref. date是08年11月份，而且该抗体的Rev是08年4月。这是不是表明我买的抗体已经过期8个月了，基本失效了？Rev对于抗体是什么时间，生产日期嘛？这种情况下，我能否要求对方换货？
谢谢

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呵呵
你说的这个时间问题我不懂
每个厂家它标时间用的单词会不一样
说实话
如果是进口抗体的话按照它的保存条件保存一般一年是不会有什么问题的
我用过的抗体有保存两年的，超出保质期都一年了，效果依旧很好
当然你可以要求退换

呵呵，谢谢方兄指点！我下次直接加裂解液试试

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直接用预冷的PBS洗3遍细胞
洗完后把PBS弃去就可以加裂解液了，按照说明书操作
不知道你用的是哪家的膜蛋白提取试剂

直接用预冷的PBS洗3遍细胞
洗完后把PBS弃去就可以加裂解液了，按照说明书操作
不知道你用的是哪家的膜蛋白提取试剂

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用的进口的，加了裂解液后必须直接做吗？因为细胞多，不能长到同时裂解，能不能加完裂解液后放到-70先冻两天，这样会不会有影响？

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用的进口的，加了裂解液后必须直接做吗？因为细胞多，不能长到同时裂解，能不能加完裂解液后放到-70先冻两天，这样会不会有影响？

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进口的是不是用的Pierce的？
把提完的蛋白放在-70度保存就可以啊
等最后一起测试呗

你说的这几个我都做过
要注意蛋白提取
PARP-1，定位在细胞核，所以你要提取核蛋白来做（这个蛋白在胞浆中很少，可能检不出来，要注意）
caspase3定位在胞浆，要用胞浆蛋白来做
cytochrome C定位在mitochondrial matrix
祝你好运

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老师您好，首先感谢您的回复，我还有两个问题，请您看看。
一、我在裂细胞收蛋白的时候，用的是碧云天的western及IP细胞裂解液（产品编号P0013），不知道能否满足我要跑的蛋白的要求。
二、今天我刚把实验室的电泳和电转的型号抄下来，针对我要跑的这三个蛋白，能否请老师给出相应的电转条件，十分感谢！
一台是Bio-Rad的Mini-PROTEAN 3 电泳系统
另一台是北京六一仪器厂的，电泳仪电源型号 DYY-6D型，电泳仪（电转）型号 DYY-7C型

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300mA 40min够了
在mini胶中上样量100ug已经很大了
你上样100ug的时候染过胶吗？（在没有转膜前）

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染过胶 我曾经用300ma 1.5个小时 染胶仍然有残留，不知道是怎么回事
电转液没有加SDS

老师您好，首先感谢您的回复，我还有两个问题，请您看看。
一、我在裂细胞收蛋白的时候，用的是碧云天的western及IP细胞裂解液（产品编号P0013），不知道能否满足我要跑的蛋白的要求。
二、今天我刚把实验室的电泳和电转的型号抄下来，针对我要跑的这三个蛋白，能否请老师给出相应的电转条件，十分感谢！
一台是Bio-Rad的Mini-PROTEAN 3 电泳系统
另一台是北京六一仪器厂的，电泳仪电源型号 DYY-6D型，电泳仪（电转）型号 DYY-7C型

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1，做PARP这个蛋白可能会效果比较差，另两个应该问题不大
2，你用湿转还是半干转？

300mA 40min够了
在mini胶中上样量100ug已经很大了
你上样100ug的时候染过胶吗？（在没有转膜前）

染过胶 我曾经用300ma 1.5个小时 染胶仍然有残留，不知道是怎么回事
电转液没有加SDS

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有残留是很正常的
你的蛋白分子量多大？