蛋白质与蛋白组学

我的目的蛋白有35-38kd，我的目的蛋白表达很少，目的蛋白是膜蛋白，怎么才能解决呢

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用提取膜蛋白的试剂
表达量少的话要提高最后检测试剂的敏感性
比如高敏感性的ECL

关于转膜
以前我们对50Kd左右的蛋白用恒流400ma1小时转膜，很好。现在用同样的条件发现转过头了，因为预染的MARKER的颜色都没有了，用丽春红染色发现膜上没有蛋白。请问是何原因？县天气炎热，转膜与温度有关系吗？
另外我看到您说恒流用1.2MA/CM2，这平方厘米是膜的面积吗？如是的话，每次转膜时裁的膜不一样，那电流也不一样是吗？
以您的经验，我分子量为38KD和59KD的两种蛋白加上内参43KD，转膜用恒流的话用400MA该多长时间？如用300MA，那需要多长时间？谢谢
丽春红染色液有使用期限吗？我怀疑是否是转膜成功但丽春红失效了。该入和判断丽春红失效呢？

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1，我认为与你的缓冲液有关，另外400mA产生的温度相当高了，一定要降温
2，是膜面积，每次都要根据膜的面积来计算电流
3，300mA 1h足够了
4，如何判断不清楚，不确定的话就重新配置一下，很简单啊

请问：
ki-67的分子量为300多，这样可以做western blot吗？

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可以啊
ki-67定位在细胞核
用细胞核提取试剂盒
300K多要用梯度胶或者大的分离胶

谢谢老师了，几天没看到还以为您出外云游了，呵呵
今天看了个操作指南，胶聚合后加了电泳缓冲液再拔梳子。而我一般是把梳子拔了再卡在玻璃板中加缓冲液，那种方法更好。

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我用拔了梳子之后再加缓冲液的操作方法
加入缓冲液之后梳孔就看的不是很清楚了
有些孔是需要修改下的

老师我以前试过用冷的PBS洗细胞有脱落的现象，查资料好像有这种可能性。
所以现在我一般是把PBS拿出来放一下再洗六孔板的细胞。
如果用冷的PBS洗细胞脱落了，是不是说明细胞本身状态就不好啊？

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如果是正常的贴壁细胞一般是不会出现这种情况的
如果是状态不好的细胞肯定会洗掉的

我用ECL显影后，整张膜都是黑的，啥原因造成的啊？谢谢了！！！

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1，二抗浓度过高
2，一抗没有纯化
3，洗膜次数不够

1，二抗浓度过高
2，一抗没有纯化
3，洗膜次数不够

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二抗现在是1：2500，一抗没有纯化的问题我们自己貌似解决不了啊，还有洗膜我是洗3次，每次10分钟，第一次显影，整张膜都是黑的，然后又压了一张片子，结果不怎么黑了，但是条带只剩actin的了，我想是不是ECL残留过多的缘故？谢谢！！

二抗现在是1：2500，一抗没有纯化的问题我们自己貌似解决不了啊，还有洗膜我是洗3次，每次10分钟，第一次显影，整张膜都是黑的，然后又压了一张片子，结果不怎么黑了，但是条带只剩actin的了，我想是不是ECL残留过多的缘故？谢谢！！！

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ECL孵育完成后要弃去
但是不能全部吸干

ECL孵育完成后要弃去
但是不能全部吸干

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是啊，我是将膜夹出来放在另一干净的保鲜膜上的，这样不可以吗？

是啊，我是将膜夹出来放在另一干净的保鲜膜上的，这样不可以吗？

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可以啊
用保鲜膜盖上
然后压片