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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-19 12:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
心脏组织提取的蛋白，上样量分为20、30、40、50ug，跑胶的情况，浓缩胶中100v压得很扁，进入分离胶后200v溴酚蓝略有弥散，marker的条带清晰、细长，转膜后95-17kd的条带都很清晰，5%milk 4°C过夜，abcam的一抗稀释到起始浓度1：200，室温孵育2h，二抗1：5000+GAPDH(1:10000)室温90min，加入ECL后整张膜都是发光的，但强度不大，曝光后只看到一片灰色，形状与膜一致，可见marker的发白的条带，看不到目的条带（95kd）。洗去一抗、二抗之后，只用GAPDH（1：10000）孵育后显影，仔细辨别才能看到隐约的37kd左右的条带，平整、细长。不知道是什么原因，是否是变性过程出了纰漏，蛋白降解而使实际的上样量极少？打算重新准备样品再试试。
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发表于 2013-1-19 12:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主，曝光的结果条带之间都成一条直线，中间没有间隔。是什么原因啊！内参也是一条直线！
先谢谢楼主帮忙解答！

============================

上样量太大
另外你注意看胶有没有凝好
分离胶凝胶时间要2h左右
可以先跑电泳染胶看看
你的浓缩胶胶孔之间梳子有问题吗？
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发表于 2013-1-19 12:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教fangweibin119……心脏组织提取的蛋白，上样量分为20、30、40、50ug，跑胶的情况，浓缩胶中100v压得很扁，进入分离胶后200v溴酚蓝略有弥散，marker的条带清晰、细长，转膜后95-17kd的条带都很清晰，5%milk 4°C过夜，abcam的一抗稀释到起始浓度1：200，室温孵育2h，二抗1：5000+GAPDH(1:10000)室温90min，加入ECL后整张膜都是发光的，但强度不大，曝光后只看到一片灰色，形状与膜一致，可见marker的发白的条带，看不到目的条带（95kd）。洗去一抗、二抗之后，只用GAPDH（1：10000）孵育后显影，仔细辨别才能看到隐约的37kd左右的条带，平整、细长。不知道是什么原因，是否是变性过程出了纰漏，蛋白降解而使实际的上样量极少？打算重新准备样品再试试。

=======================================================

心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试
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发表于 2013-1-19 12:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主我补充下问题：
我做的是脑组织抽提蛋白的WB，几次发光后都发现 胶片上显示的beta-actin连成一条线，各样品中间没有分隔，起初认为是因为加样时蛋白漏出，但是现在已经非常注意，基本没有漏出的问题了，但是还是没有解决连成一条线的问题，非常郁闷，请楼主帮忙出出主意，问题出在哪里。非常感谢！蛋白是刚提的，用的是碧云天WB试剂！
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发表于 2013-1-19 12:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 H2O 于 2013-1-19 12:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主我补充下问题：
我做的是脑组织抽提蛋白的WB，几次发光后都发现 胶片上显示的beta-actin连成一条线，各样品中间没有分隔，起初认为是因为加样时蛋白漏出，但是现在已经非常注意，基本没有漏出的问题了，但是还是没有解决连成 ...

这和漏不漏影响不大
应该是你总体蛋白的上样量太大
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发表于 2013-1-19 12:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！
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发表于 2013-1-19 12:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好！我现在用western做分子量20KD和43KD的蛋白，电泳条件是50V，80V，然后用考马斯亮兰染色，但完全看不到条带（marker也看不见）。
请问可能是什么原因导致的？
谢谢楼主！
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发表于 2013-1-19 12:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

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120ug总蛋白？
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发表于 2013-1-19 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

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用多大厚度的胶？
几孔的？
上样量太大了
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 小中大
楼主你好！我现在用western做分子量20KD和43KD的蛋白，电泳条件是50V，80V，然后用考马斯亮兰染色，但完全看不到条带（marker也看不见）。
请问可能是什么原因导致的？
谢谢楼主！

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说的具体些
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