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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-15 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再问方老师一个问题，strip buffer 的配方是什么啊，我只用NaOH洗膜，感觉洗不干净。谢谢！！！

=================================

NaOH我用过，效果很差哦
具体配方恕我不能告诉你
因为这是公司研发的产品，有保密协议
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发表于 2013-2-15 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您上次说上样40UG内参就应该比较好看了，请问下如果是样本一般上多少比较好，有的资料是50-80，有的是30-50？

======================

蛋白定量时会有很大误差
建议SDS-PAGE来验证
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发表于 2013-2-15 12:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我转膜的缓冲液和sermester
的一样，但也是要湿转，请问谁有抗体技术实验指南这书啊，好好学习一下~

=================

请问：
你的胶也变小吗？
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发表于 2013-2-15 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：
你的胶也变小吗？

===================

没有变小
胶很正常
我湿转与半干转都做
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发表于 2013-2-15 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做出的条带总是皱眉状，我用的4%的积层胶，12%的分离胶，这个做的是B-ACTIN,条带总是很粗，皱眉状。我上样量已经减少到4微克蛋白了。不知道是碧云天的BCA蛋白定量试剂盒不行还是怎么回事？发两张图给老师看看。都是ACTIN的，望老师指点。


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发表于 2013-2-15 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思，我刚才说错了是5%的积层胶
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发表于 2013-2-15 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天第一次做western，结果电转转出了一张实验室里大家都没见过的很糟糕的膜，发出来让大

家开心开心，顺便请教前辈，这可能是什么原因？所用的电转液配方是Tris 2.375g,甘氨

酸11.25g，甲醇200ml，SDS 0.375g，加三蒸水到1000ml。目的蛋白是95kD，转膜条件是2

200mA,120min。丽春红染色没有任何条带，而且整个膜开起来很奇怪。


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发表于 2013-2-15 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做出的条带总是皱眉状，我用的4%的积层胶，12%的分离胶，这个做的是B-ACTIN,条带总是很粗，皱眉状。我上样量已经减少到4微克蛋白了。不知道是碧云天的BCA蛋白定量试剂盒不行还是怎么回事？发两张图给老师看看。都是ACTIN的，望老师指点。

====================================================================================

1，蛋白定量肯定会存在误差，WB结果条带会有差异，通过WB的结果扫描读数才能进行下一步上样量的调整
2，我认为你电泳的时候热量产生太多，没有采取降温措施吧
3，转膜也是需要降温的
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发表于 2013-2-15 12:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天第一次做western，结果电转转出了一张实验室里大家都没见过的很糟糕的膜，发出来让大

家开心开心，顺便请教前辈，这可能是什么原因？所用的电转液配方是Tris 2.375g,甘氨

酸11.25g，甲醇200ml，SDS 0.375g，加三蒸水到1000ml。目的蛋白是95kD，转膜条件是2

200mA,120min。丽春红染色没有任何条带，而且整个膜开起来很奇怪。

========================================

用的是什么膜？
NC不需要活化，在转缓中浸泡平衡就可以用了
PVDF需要无水甲醇活化，然后在转缓中平衡
封闭后染的膜吗？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-2-15 12:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：
你的胶也变小吗？

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胶倒是不会变小的。
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