蛋白质与蛋白组学

谢谢老师
但是我封闭用牛奶，稀释抗体用bsa可以吗？（处于节省成本的原因）两相是否矛盾？
另外一个问题是，老师以您的经验来看，洗一二抗的strip buffer（为了染内参），一般可以反复用几次效果就不行了？说明书上没有此类说明，它的意思应该是用完就倒掉。但是成本实在太高了。
谢谢老师的回答

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最好用同一封闭体系
2到3次应该是没有问题的

谢谢老师
但是我封闭用牛奶，稀释抗体用bsa可以吗？（处于节省成本的原因）两相是否矛盾？
另外一个问题是，老师以您的经验来看，洗一二抗的strip buffer（为了染内参），一般可以反复用几次效果就不行了？说明书上没有此类说明，它的意思应该是用完就倒掉。但是成本实在太高了。
谢谢老师的回答

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次数增加会影响你的抗体洗脱效果

我的目的蛋白是分泌性糖蛋白分子量39.6KD。想请问您怎样才能提高蛋白提取效率，因为我的目的蛋白表达量很少
不好意思呵，请版主指教

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你做组织还是细胞？
如果细胞的话分泌性糖蛋白是分泌到细胞外还是？
组织的话用组织裂解液提取

求助：
做WB时，显影压片后，背景很强，整张膜都显影的，不知道是什么原因？自己觉得可能是封闭的原因或者二抗浓度过高的原因，但是同时用牛奶和BSA都封闭试过了，而且封闭时间接近2小时，一抗是abcam的，做iNOS(推荐浓度是1：200，我用1：200、300都试过了），二抗1：8000、10000都试过，结果都一样，请老师能不能帮我解答下。附加说一下，我的内参是用同样的条件，做的非常漂亮。

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iNOS一抗用1：400，1：1000
二抗用1：20000及1：40000

楼主你好~
我做WB快一个月了，但都没有得到结果~想请教你几个问题，具体情况如下：

目的蛋白：43KDa 样品：贴壁细胞裂解上清液 内参：Tubulin（55KDa）
预染marker、标准品、样品分别上样后电泳：
5%浓缩胶60v/30min；10%分离胶100V/50min；考马斯染色后条带清晰
湿转90V/50min（PVDF膜），转膜后膜上预染marker条带清晰且转膜后的胶染色后无条带
5%MILK室温封闭2h
一抗（目的蛋白一抗1：1000+内参一抗1:1000）室温孵育1小时，TBST洗涤3次*10min
二抗1：5000室温孵育1小时，TBST洗涤3次*10min
ECL显色

第一次的结果是：有标准蛋白的条带以及样品中内参的条带，只是没有样品中的目的蛋白的条带。
再重复以上实验时所得到得结果均是：只有样品中内参的条带，连标准品的条带都没有了。

我之前怀疑是目的蛋白的一抗出现问题，于是另外用一小张膜，预处理后在上面直接滴加了一小滴目的蛋白的标准品溶液，然后同电转过后的膜一起封闭、孵育一抗二抗并显色，结果显示电转的膜仍然只有内参的条带而小膜上却出现了光点，这应该可以说明我的一抗二抗都没有问题。

请老师帮我分析一下，导致这种结果出现的原因是什么？应该怎么改进呢？

万分感谢！！！

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1，目的蛋白与内参先分开孵育（当然两者预实验条件摸好的情况下可以混合一起孵育）
2，目的蛋白可能没有提取出来

1，目的蛋白与内参先分开孵育（当然两者预实验条件摸好的情况下可以混合一起孵育）
2，目的蛋白可能没有提取出来

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即使样品里面的目的蛋白可能没有提取出来，但是我有目的蛋白的标准品作为对照啊!第一次做的时候标准品的条带都出来过，后面几次就没有了,只有内参的条带~这是怎么回事呢？请老师帮我分析一下~谢谢~

即使样品里面的目的蛋白可能没有提取出来，但是我有目的蛋白的标准品作为对照啊!第一次做的时候标准品的条带都出来过，后面几次就没有了,只有内参的条带~这是怎么回事呢？请老师帮我分析一下~谢谢~

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从这些来分析的话只能说一抗可能降解了
你每次用新的一抗吗？

刚接触western blot,请问组织取材多大才够？限于取肠镜下肠粘膜组织，不能取很多，希望各位大侠指点一二，最少量多少才够？需要测三个指标。

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3个指标30至50mg足以