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标题:【讨论帖】western blot问题解答

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-2-20 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有问题想要问您，如下：
我的蛋白浓度太高了，在20-30ug/ul，我们的样品蛋白用5X的loading buff 稀释（按样品：buffer=4：1）后煮变性。如果我们取上样量为100ug。上样的样品体积太少了。。。。。我请教了一些同学，他们说，可以再加2X或者3X的loading buffer补充上样体积。是否可以。。。。还有请问，如何将5X的loading buffer 稀释成2X或者3Xloading buffer。谢谢，期待您的回答。。。。
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-2-20 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位前辈，请帮忙指点一下：
我前几天做四株癌细胞一目标蛋白表达量的比较，每株细胞设两个重复，前两株细胞目标蛋白表达均较高，条带较直，后两株细胞不表达，接着我又优势B-action想看看是不是样的问题，结果B-action比较弯，有点像逗号，并且后两个样中各有一个样B-action 没有表达，请问是哪里出了问题呀？我该注意些什么？急！！！！
先谢谢你们了！
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发表于 2013-2-20 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问如果我做组织蛋白 如果不是新鲜做 我的组织要怎么保存 可以保存在液氮 或者是﹣80°冰箱中吗？？
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发表于 2013-2-20 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
肝癌
NBA你好，非常感谢你的帮助，我做WB也有两个月了，近来跑电泳考染后发现15kD以下蛋白就没了，蛋白从肝癌细胞和肝癌组织中分别提取的，胶浓度是15%的，电泳55v30分钟，80v50分钟，麻烦你帮我分析一下。
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发表于 2013-2-20 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好 附图是我做的细胞提取蛋白胶片 5%脱脂奶粉室温封闭1h，santa一抗1：1500，用脱脂奶粉稀释，二抗1：5000，用TBST稀释，ECl反应1min，出来背景很深，看不到条带；之前做过一个蛋白可以看见条带，但就是在条带周围也有这样的背景，麻烦帮我分析一下原因


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发表于 2013-2-20 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

向版主求助！我W的条带总是很弥散，而且很浓，曾出现过反影。调低一抗浓度合适吗？之前怀疑是蛋白讲解，但是新抽的蛋白也是这样。但用同门的蛋白一样的电泳及转膜条件就是很漂亮的条带！蛋白的抽提方法一样的，而且我也亲自抽过同门的蛋白。我的蛋白是110k，在160的位置有修饰后的条带。弥散的条带的位置是对的。电泳：80V浓缩胶后110v分离，300ma恒流湿转2.5～3h。不知问题出在哪里？非常感谢！！！
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发表于 2013-2-20 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原来一直用这个样品做的 我是做好样品之后加lodding buffer煮沸变性后分装保存的 -20保存的 不过时间可能长了点 有一个多月了，

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不知道你这个蛋白是不是容易降解
换新样品试试
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发表于 2013-2-20 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好，请再帮我分析一下转膜后出现这种情况的原因 （做了好多次电泳，转膜后都出现这样的现像，请问这是什么原因呢？我觉得可能是做三明治的明胶海棉太老了，中间薄周围厚，有的地方都有了小洞，但别人也是用这些海棉做的，没有出现这种现像）转膜时电流300mA，时间2小时，目的蛋白80KD。

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感觉像是胶与膜之间有挪动
转移时温度太高
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发表于 2013-2-20 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问如何计算转膜电流和时间？
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-2-20 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好，请教条带大小分别为41KD、60KD、85KD的蛋白用NC膜湿转时的条件？电流和时间等。还有什么要注意的问题？先谢谢了

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可以选择一个适中的时间把这三个蛋白都搞定
300mA湿转，1h20min
0.45um孔径NC膜
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