蛋白质与蛋白组学

降低一抗二抗浓度

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之前做一个蛋白条带出来了 但是也是背景有的地方很高 而且条带看上去也不是很明显的 如果我降低一抗二抗浓度的话 蛋白条带会不会更不明显呢

版主你好，请您指教。
我们老板要我们测体液（血/尿）里面的目的蛋白，大概会按照国外文献的方法来检测（据报道脑脊液，尿液，泪液etc可以检得出来）：先用差速离心（20万G）获得蛋白样品，据文献说此时得到是“目的蛋白-Containing Membrane Particle”，然后再去做WB，ECL。
以往没做过WB。
问题：1. WB检测的是蛋白质吧，那么这种离心后得到的“目的蛋白-Containing Membrane Particle”老外既然作出来结果了，它跟平时做的WB会不会不一样。文献上好像就是平时WB的方法。
2.血/尿中的目的蛋白估计会很少，如何除杂，提高目的蛋白的检出率，就是说血清蛋白和尿蛋白一般WB的方法是怎样的。
3.定量WB的方法。
非常感谢。

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这方面的WB没做过
WB是检测蛋白的

请问： 做WB的内参显影后总是连在一起成一条线 是怎么回事？？大概能看出各个孔的条带，但是连线太厉害了。。 后来我隔一个孔点样，内参倒是分开不连线了，但是边缘效应很明显，点在边上的样品，内参明显不如中间的亮 真不晓得怎么办了。。。。
特此请教，谢谢～～

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降低上样量

感谢版主及时回复！我的胶都是4度过夜配好后第二天用的。此外帮同门W的基本都是漂亮的条带。希望你能帮我找找原因，不胜感激！

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转膜时降温
另外调整一下抗体稀释度

您说的抗体稀释是一抗、二抗都要稀释么？我的一抗浓度现在用的是1：1000，四度孵育过夜；二抗1：3000，37度一小时。

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是的

之前做一个蛋白条带出来了 但是也是背景有的地方很高 而且条带看上去也不是很明显的 如果我降低一抗二抗浓度的话 蛋白条带会不会更不明显呢

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在合适的稀释度时是不会的
现在摸索条件就是找一个合适的点

VEGF我做过细胞总蛋白的
没有阳性条带
HIF-1没有问题
有结果
用胞浆、胞核蛋白抽提试剂来分别提取胞浆、胞核蛋白
因为HIF-1会在胞浆与胞核中移动
做WB时胞浆、胞核蛋白都要检测

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您好！正如你上次所说HIF-1a没有问题，可是我们实验室一直就没做出过这个蛋白，恳请问您一下你们是用的什么细胞？常氧培养还是低氧、缺氧？WB操作过程中有没有特殊的要求（因为有人说HIF-1a很不稳定，遇氧分解，收蛋白，定标等都应避免与氧接触，可是我们觉得这个条件很难实现）？急盼你的答案，谢谢！

[ 本帖最后由 831226 于 2013-2-20 17:22 编辑 ]

再次打扰你，前几天做了个斑点印迹，拍的照片好奇怪，请你帮我分析一下啊

[ 本帖最后由 66+77 于 2013-2-20 17:29 编辑 ]