蛋白质与蛋白组学

我用的是伯乐半干转，转移缓冲液配方是：
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
蒸馏水至 1000ml
我做的蛋白是cPLA2-a，文献上分子量是85-114（好几个版本，具体不清楚是哪个），请问我的转膜条件：24V 50min可以吗，我做了3次，条带没怎么看到。
还有，背景很脏，我二抗浓度已经调整到1：10000了，背景还是脏，洗膜TBST，15min，3次。（另一个抗体一起洗膜的，背景就很干净）请问应该怎么调整。谢谢

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转膜条件肯定不行
建议：半干，1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转膜2h
你的原因首先就是蛋白没有转上
先把这个问题解决了再定下一步的实验条件

您好！正如你上次所说HIF-1a没有问题，可是我们实验室一直就没做出过这个蛋白，恳请问您一下你们是用的什么细胞？常氧培养还是低氧、缺氧？WB操作过程中有没有特殊的要求（因为有人说HIF-1a很不稳定，遇氧分解，收蛋白，定标等都应避免与氧接触，可是我们觉得这个条件很难实现）？急盼你的答案，谢谢！

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我们做的是大鼠骨骼肌组织
在常压低氧条件下运动
最近用santa 的抗体在做HIF-1alpha（Jurkat细胞）
暂时无结果

再次打扰你，前几天做了个斑点印迹，拍的照片好奇怪，请你帮我分析一下啊

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蛋白上样量太大
向外扩散了

版主，你好
我最近做了western，跑GAPDH已经跑的很好了，但是目标蛋白就是没有任何条带。
我要提的蛋白是100kd左右的分泌型的蛋白（以前认为是膜蛋白），因为经费问题，裂解液是自己配的，和文献上对比少加了去氧胆酸钠和一些酶抑制剂，多加了0.1%sds。上样量达到了200ug，并做了阳性对照。一抗是abcam的，兔多抗，电泳用10%的胶，转膜用250ma 2小时，曝光用了30min，ECL用thermo的，二抗用kpl的goat抗兔的，只有一次看到杂带。内参是GAPDH的鼠抗，用康城的一抗，内参二抗也是kpl的hrp。
整张膜就是没有任何条带。只有一次在40kd左右出现了条带，后来就没有了，现在考虑究竟是
1.裂解液的问题，没有裂解好？我看到文献说是不是不需要加SDS，还是应该加上去氧胆酸钠，我手里有熊去氧胆酸，是不是就是去氧胆酸钠？但是GAPDH能做出来，说明裂解液没啥问题啊，分泌型的蛋白应该可以裂解出来的啊，为什么文献里还加了去氧胆酸钠？
2抗体的问题？我已经投诉了抗体。
3是不是考虑标本有问题？

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1，你做的是什么来源的？组织还是细胞
如果是组织分泌型的可以做，但是细胞的话就分泌到培养液中了
2，脱氧胆酸钠是破膜的，同时能提取膜蛋白
3，蛋白酶抑制剂是非常重要的！
4，能做出GAPDH只能说明WB后续步骤没有问题
并不能说明能把你的目的蛋白提取出来