蛋白质与蛋白组学

1，你做的是什么来源的？组织还是细胞
如果是组织分泌型的可以做，但是细胞的话就分泌到培养液中了
2，脱氧胆酸钠是破膜的，同时能提取膜蛋白
3，蛋白酶抑制剂是非常重要的！
4，能做出GAPDH只能说明WB后续步骤没有问题
并不能说明能把你的目的蛋白提取出来

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用的是组织来源的。

你好，我做WB有一个月了，跑出来的条带总是几个孔连成一条线，请教过一些实验室的师兄师姐，有说是胶做得不好，也有说是上样量太大，但是减少上样量并严格按照碧云天PAGE胶配制试剂盒说明重复试验后还是很难看。放上今天曝的图，麻烦你帮我分析一下:
1.泳道间没有分开的原因？如何改进？
2.为什么同样大小的蛋白，几个泳道间位置也不太一样，中间跑得比两边快？
3.几乎每次电泳都会出现图3的情况，样品从孔底部像两边溢出（并没有刺穿孔），如何解决？

我的条件是电泳浓缩胶80V，分离胶100V；转膜250mA，100min；上样量10-20ug；每孔体积25ul；胶凝固时间是各30min。谢谢！

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1，蛋白定量可能有问题
2，上样量减少一半
3，分离胶聚合时间1h30min
4，位置不一致是因为梳孔之间有高低
5，跑电泳时凝胶底部有气泡
6，浓缩胶是不是有破裂的情况

请问一下，我想提取组织的蛋白。但标本数目不够，不能同时提取。需要加什么试剂吗？有同学说加蛋白酶抑制剂，但具体不知道怎么操作，不知道能不能指导一下，谢谢！

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-80或者液氮冻存
一块提取
另外蛋白酶抑制剂是在提取蛋白的时候加

版主你好：
再请教您一个问题。我用的是湿式电转。转移buffer 配方是：0.1%SDS，20%甲醇，Tris,Glysine.目的蛋白是17KD。可以推荐一下您认为合适的转膜条件吗？

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我选择用湿转
300mA 15~20min
用0.22um膜

老师您好，我按您的意见重新做了一下western，把一抗和二抗的浓度都下调了一下，但ECL显色后仍是出现如图1的结果；然后我又在相同的western条件下用DAB显色，得到了如图二的结果，貌似蛋白条带出现了，但不是很清楚，您分析一下，我的实验可能是哪出了问题，会不会是显色底物或抗体的问题，谢谢。

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抗体稀释度需要加大
ECL敏感性高于DAB
也就是ECL操作能节省抗体

请问老师 我做的是10KD的SDF-1a目的蛋白 做了1个多星期了目的蛋白一直未出条带。我们实验室用的是tris,甘氨酸-SDS-PAGE bio-rad 系统 湿转 请问老师该用什么条件？

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用Tricine-SDS-PAGE试试吧

用的是组织来源的。

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继续做啊

1，蛋白定量可能有问题
2，上样量减少一半
3，分离胶聚合时间1h30min
4，位置不一致是因为梳孔之间有高低
5，跑电泳时凝胶底部有气泡
6，浓缩胶是不是有破裂的情况

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多谢指导！还想请问如何避免凝胶底部的气泡以及如何防止浓缩胶破裂？

多谢指导！还想请问如何避免凝胶底部的气泡以及如何防止浓缩胶破裂？

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1,拔梳子时不能前后动，只能左右移动
2，胶底部的气泡要用灌胃针进行吹打