蛋白质与蛋白组学

你好，我在做磷酸化的P38和ERK。我想问下p-p38分子量是多少，说明书上说是43kd，但网上查的怎么是38kd？
还有我SDS-PAGE考染的，有明显条带，但在43-34kd之间好像没条带，很淡，隐隐约约的，20ul上的样，没定量，不知道是多少ug，是不是蛋白浓度太低？这样能做出WB结果吗？因为我做的WB背景总是很深，带又弱，很难辨认

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1，分子量问题看说明书
2，没测定蛋白浓度？不知道上了多少微克啊
3，磷酸化蛋白注意蛋白提取时加入磷酸酶抑制剂
4，背景问题需要认真解决

是的，同一个样品，等量上样，结果却相差很大，不知是什么原因？
还想请问，转膜的三明治中滤纸、胶、膜的大小如果不能完全一样大，那么它们的大小顺序是什么？

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1，转膜时气泡没有完全赶好
2，孵育抗体的时候整个体系量太少抗体没有孵育好

前辈你好！我最近做western正郁闷呢，内参出来了，但是目标蛋白始终没出现，我的目标蛋白108KD,75V恒压转膜2小时，预染marker转的很好，没染丽春红，直接封闭，一抗常温2小时，二抗1:1000 1小时,内参出来了，目标蛋白始终没有出现。转膜液没加0.1%的SDS,这个影响大吗？
我是从组织里用RIPA提的全蛋白，目标蛋白是膜蛋白。

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1，膜蛋白不好提取，有可能没有提出来
2，膜蛋白名称告诉我一下
3，抗体问题

各位大侠，各位前辈，在下实在快疯了。
WB做了大半年，原来很好做的指标现在做不出来了，条件前后一摸一样的，显影就是一片空白，一点带的影子都没有。二抗也换过了，难道一抗失效了？还没有过期呀，一直放在-20度的。蛋白做内参没有一点问题。
帮忙分析下可能的原因吧，万分感谢！

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1，抗体失效
2，蛋白降解

各位老师，有没有人做过130kd的BMPR2，请指教。标本取自大鼠肺组织，用普利莱公司的RIPA裂解液，BCA测蛋白浓度为5.8ug/ul。上样量做过10ul，30ul，45ul，60ul。用8%的胶，80V恒压电泳。考马斯亮蓝染色后发现70kd以下的条带很多，100kd以上的条带几乎看不见，170kd的条带又可见。我的BMPR2为130kd。我们实验室只有半干转膜仪，采用恒流，2mA/cm2转2个小时、2mA/cm2转2个半小时，2.5mA/cm2转2个半小时都做过，用立春红染膜看不见明显条带。一抗用BD公司的，1：500（推荐1：250-1：1000），二抗1：1000，没有条带显影。请各位老师指教。

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1，膜蛋白不好提取
2，普利莱的RIPA能提膜蛋白吗？我没用过，你咨询下
3，问题可能出现在蛋白提取上