蛋白质与蛋白组学

你好，我是做western的新手，现在在做B-actin摸条件，但是几次下来结果都一样，图在后面。具体步骤是：
1、thermo公司的细胞裂解液+pmsf裂解细胞。BCA试剂盒定量蛋白，2×sds上样缓冲液100度变性10min
2、10%的分离胶，100V电泳
3、100v转磨2小时，冰浴
4、5%脱脂奶封闭2小时
5、I抗sigma的单抗1：3000过夜
6、rockland公司的II抗1：1000 2小时，odyssey显色

我想了好多方面的问题，但是maker是好的，说明胶的配置没有问题，转膜也没有问题，刚开始我以为是I抗的问题，从其他人那里讨了一点做过正常的也不行，如果是封闭的不好，但是背景还是蛮干净的，应该不是封闭的问题。
是不是收集蛋白的时候只加PMSF一种蛋白酶抑制剂不行呢，有蛋白降解了？
谢谢！

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目的蛋白没有提取出来

我也碰到了像楼上“不高兴和没头脑”一样的问题----“几乎整张膜都发光，像盏黑夜里的明灯，指引我走向失败。”
太诡异了，同时做了两个膜，一个膜（目的1和内参1）洗的很漂亮，但是另一个膜（目的2和内参2）就整个很亮，还没有条带。两个膜除了用的一抗不一样外，其他条件都是相同的，更郁闷的是前段时间只是内参2出现这种情况，现在传染的目的2这样了（目的2，内参2不久前用一样的条件都洗出来过呀）。到底是咋回事呀，崩溃了。求老师帮忙解救一下啊。

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说的具体点

请问版主，IOD值怎样确定上样量？谢谢

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计算内参IOD值，确定一个标准调整上样量

前段时间我一师弟做过这个蛋白
抗体可能不一样
全蛋白裂解液应该能提出这个蛋白
还有抗体有多长时间了？

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抗体有半年了。

请问版主：我做的WB，以前做的还可以，休息2个月换了裂解液（同一个蛋白）ris-HCl: 50 mM, pH 7.4
NP-40: 1%
Na-deoxycholate: 0.25%
0.1%SDS
EDTA: 1 mM
PMSF: 0.5 mM
Aprotinin、1mM， leupeptin、 0.5nM
Na3VO4: 1 mM
NaF: 1 mM
一、二抗都是ABCAM的我用一抗1：10000、二抗1：5000，3%BSA稀释 结果没有条带（5%奶粉封闭），整个膜上看到好多荧光成片的曝光出来只是几个点或片；3%BSA封闭能看到条带但整个背景很深，杂带很多。 我怀疑我的蛋白提取有问题。我用actin做的内标内标出现条带但也有杂带，而且明显的三条杂带，这是内标多抗本身就会出现的吗？

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裂解液中可以加入150mM NaCl
整个过程中抗体换了吗？
所有的buffer换了吗？

版主你好：我要提的是胞浆蛋白分泌型的您是否可以提供专门的裂解液，在线等谢谢

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呵呵
没有
分泌型蛋白你可以考虑用ELISA啊

版主你好：我要提的是胞浆蛋白分泌型的您是否可以提供专门的裂解液，在线等谢谢

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另外你做的是组织还是细胞？
如果组织的话你可以用提取总蛋白的形式来做WB