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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-21 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是早上现磨的心肌组织，共6组。下午测浓度，都很顺利。但是测完浓度样品加入Loading Buffer热变性后，有三组的样品变成了黄绿色，而其他三组还是正常的蓝色。

Loading buffer是好的，考虑是蛋白出问题。准备明天重新磨组织再看看。但是不知道是什么原因？？？还望各位指点。
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发表于 2013-2-21 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有个问题请教楼主：

我按照你介绍选择二抗稀释倍数的方法

做了二抗点样NC膜之后DAB显色的试验

结果如图所示，请问我应该选择哪一个做为我二抗的稀释倍数呢

标示的数值对应的稀释倍数为

1、1：2500

2、1：4000

3、1：5000

4、1：6000

5、1：8000

6、1：10000

7、1：20000

请帮我看看方法对不对，并帮我选择一下合适的二抗稀释倍数

另外我对一抗的稀释度还不清楚，该怎么做呢？


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发表于 2013-2-21 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天转膜发生了一件奇怪的事：
转膜条件和以前一样，半干转，20V，1h
转膜之前，胶上有Maker
转膜之后，胶上，膜上都没有Maker了，下层滤纸上也看不见。
具体有没有转上，要看明天的显影结果了。

这是怎么回事呢？
很是疑惑。。。
请教了，谢谢~
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发表于 2013-2-21 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教高手一个问题，我们实验室的同学告诉我说如果第一次发光不理想，可以把膜洗洗，重新加上发光液，再次发光，（不是加抗体，只加发光液），并且他们说可以发出来，我试了一次，没有发出来，并且从理论上来讲，好像也是讲不通的，因为发光也不是和二抗反应吗？能把发光液洗掉吗？不知道有没有战友这样做过，多谢！！！！
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发表于 2013-2-21 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人做了WB一段时间，只是现在想要数据处理了，我用的是ECL曝光之后，那X胶片就放着，扫描了一下，然后用quantity one软件处理，这样可以吗？
最近知道有人用凝胶成像系统，CCD照相，这个是在曝光的时候照的相还是最后将X胶片放进去用自带的软件进行数据处理？
谢了！
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发表于 2013-2-21 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主怎样可以曝出很干净的片子，除了封闭和抗体浓度外还要注意些什么？甲醇激活PVDF膜的时间长短对转膜效果会有很大影响吗？

======================

漂亮的片子得看整个系统
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发表于 2013-2-21 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，f想请教你个问题：我的目标蛋白一个是26kd的，一个是18kd的，用的内参是β-actin分子量是43kd的，这三种蛋白我一起湿转，100V，25min。结果43kd的和18kd的都转出来了，就是26kd的没转出来。转膜液是Tris，甘氨酸，水，和20%甲醇。膜是pvdf膜。应该不是贴膜的问题，因为膜的面积很大。请问你这事怎么回事啊，急啊！

===========================

43K的都出来了26K可能没转出来
你用什么方法确定有没有转出来？
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发表于 2013-2-21 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位前辈，请问我以前用过的脱脂奶粉，今年五月份就过期了，现在接着用对实验有没有影响？

==============

再买一包新的
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发表于 2013-2-21 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位前辈，我半干转后发现滤纸之间有许多小泡，尤其是最低的滤纸和石墨之间，这样对转膜有什么影响吗？是不是我以前内参变形跟这个有关系呀？有没有什么办法可以改进一下？我每次都很认真的赶气泡了，还是有.

====================================================

气泡的问题你可以这样解决
加缓冲液，放滤纸，再加缓冲液，放膜.....每步都加上缓冲液进行
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发表于 2013-2-21 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是早上现磨的心肌组织，共6组。下午测浓度，都很顺利。但是测完浓度样品加入Loading Buffer热变性后，有三组的样品变成了黄绿色，而其他三组还是正常的蓝色。

Loading buffer是好的，考虑是蛋白出问题。准备明天重新磨组织再看看。但是不知道是什么原因？？？还望各位指点。

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是不是变性时污染了
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