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标题:【讨论帖】western blot问题解答

jujuba[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼主慷慨解答！但是我还有一个问题：摸浓度和我现在做wb就相差几天，抗体也是新定不就，所以我觉得应该好像不是抗体降解的问题。还有楼主说的缓冲液是电转液嘛？我液是新配的。呵呵楼主能再帮我想想还有可能是什么问题嘛？谢谢！！！
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发表于 2013-2-21 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主你好，请问怎样确定我的一抗有没有问题呢？
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教楼主一个问题，我的74KD,66KD,及内参42KD的转膜条件都是90V，90mins。但是丽春红染色出来条带好像不是很明显，蛋白上样量是15ug。楼主帮我看看转膜条件合不合适。谢谢！
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发表于 2013-2-21 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问版主：这是我的问题（有两张图），请帮我看看，谢谢！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15622038&sty=3')
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发表于 2013-2-21 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主慷慨解答！但是我还有一个问题：摸浓度和我现在做wb就相差几天，抗体也是新定不就，所以我觉得应该好像不是抗体降解的问题。还有楼主说的缓冲液是电转液嘛？我液是新配的。呵呵楼主能再帮我想想还有可能是什么问题嘛？谢谢！！！

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样品缓冲液
抗原有反复冻融吗
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发表于 2013-2-21 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好，请问怎样确定我的一抗有没有问题呢？

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用阳性对照样品来做
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发表于 2013-2-21 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主一个问题，我的74KD,66KD,及内参42KD的转膜条件都是90V，90mins。但是丽春红染色出来条带好像不是很明显，蛋白上样量是15ug。楼主帮我看看转膜条件合不合适。谢谢！

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转膜我用恒流：300mA，1h30min
上样量15ug你是组织蛋白还是细胞蛋白？
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jujuba[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1，一抗浓度不合适
2，一抗特异性不好
3，封闭等用BSA

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我用的一抗是能交叉抗人、兔和小鼠的，是多抗吧？我试了几个一抗浓度，1：1000感觉条带不怎么清晰，1：4000基本没有条带了，1：2000效果相对最好，目的条带和杂带都很清晰，但杂带太多，虽然背景不太脏，但泳道中上下每条带之间都不干净，有点黑。我用的二抗始终是1：10000，是不是还需要摸一下二抗的浓度嘞？我二抗洗一小时的，每次5min。
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发表于 2013-2-21 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，今天问了同学她建议我恒流250mA，2小时；我今天用你的转膜条件做一次。我的是组织蛋白。
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发表于 2013-2-21 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的一抗是能交叉抗人、兔和小鼠的，是多抗吧？我试了几个一抗浓度，1：1000感觉条带不怎么清晰，1：4000基本没有条带了，1：2000效果相对最好，目的条带和杂带都很清晰，但杂带太多，虽然背景不太脏，但泳道中上下每条带之间都不干净，有点黑。我用的二抗始终是1：10000，是不是还需要摸一下二抗的浓度嘞？我二抗洗一小时的，每次5min。

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不是说和人、兔和小鼠有甲叉反应就是多抗
要看抗体来源，说明书上有说明的
背景问题增加洗膜次数
特异性不好只能是换一抗了
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