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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-21 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，今天问了同学她建议我恒流250mA，2小时；我今天用你的转膜条件做一次。我的是组织蛋白。

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那你先试试这个条件吧
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主你好，考染没看到目的蛋白，能继续往下做吗？
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我做WB跑胶时，看加的样品跑的弥散，最后发光整个泳道都有显色，您说这是蛋白样品的问题，还是其他的什么问题呢？特此向NBA老师请教，谢谢!
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发表于 2013-2-21 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，请问，分子量180KD的蛋白，用的彩虹Marker指示部分为分子量73KD的蛋白已经跑到胶底，电流为10mA，这是停止电游。转膜用的半干转，40mA1.5小时，后45mA30min。可是免疫反应后没有条带，大家都说是蛋白没有转上去。请帮忙分析一下原因。另外，我下次做的时候，电泳和转模时，电压，电流时间要多久呢。听说分子量打的用湿转比较好，半干转可以么。谢谢！
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发表于 2013-2-21 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好！WB中膜上用丽春红染色可以看到目的蛋白条带，但是经过免疫反应以后，却什么也曝不出来，在暗室里也看不到亮亮的条带和背景，能帮忙分析下原因么？
PS：1.目的蛋白：27KD，
2.一抗：1：200 二抗：1：3000
3.显影定影液体都是新配的，没有问题。
谢谢您的解答
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发表于 2013-2-21 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好，考染没看到目的蛋白，能继续往下做吗？

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不建议你往下做
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发表于 2013-2-21 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我做WB跑胶时，看加的样品跑的弥散，最后发光整个泳道都有显色，您说这是蛋白样品的问题，还是其他的什么问题呢？特此向NBA老师请教，谢谢!

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蛋白SDS-PAGE染胶结果如何？
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，请问，分子量180KD的蛋白，用的彩虹Marker指示部分为分子量73KD的蛋白已经跑到胶底，电流为10mA，这是停止电游。转膜用的半干转，40mA1.5小时，后45mA30min。可是免疫反应后没有条带，大家都说是蛋白没有转上去。请帮忙分析一下原因。另外，我下次做的时候，电泳和转模时，电压，电流时间要多久呢。听说分子量打的用湿转比较好，半干转可以么。谢谢！

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是不是膜蛋白？
膜蛋白不太好做
另外转膜建议湿转：300mA 2h或者2h30min
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好！WB中膜上用丽春红染色可以看到目的蛋白条带，但是经过免疫反应以后，却什么也曝不出来，在暗室里也看不到亮亮的条带和背景，能帮忙分析下原因么？
PS：1.目的蛋白：27KD，
2.一抗：1：200 二抗：1：3000
3.显影定影液体都是新配的，没有问题。
谢谢您的解答

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蛋白名称告诉我
一抗是什么告诉我：货号及厂家
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，
从组织提的蛋白，分子量52kd，上样量60ug，80v，120v电泳，400mA 10v 28min半干转，5%脱脂奶粉37度摇床封闭1小时，一抗 1：500 1%脱脂奶粉稀释（5%脱脂奶粉200+800TBST） 4°C孵过夜，国产二抗1：1000（已经做出来蛋白的条件），现在做的是相同的蛋白不同的组织。 37度摇床1小时。TBST洗膜3*10min（2抗后洗6*15min）。发光剂是碧云天ECL PLUS。
一抗 1：500 无条带
一抗 1：300 有的孔道有条带 有些没有
做内参1：100到1：400 （效价低）也是同样的问题
染色后孔道都有清晰的带 分开的不错（就是带很细）
请问fangweibin119
可能是那里出问题了？ 该如何解决
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