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标题:【讨论帖】western blot问题解答

remenb[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的基因是核蛋白可以提总蛋白做出来吗，怎么检测提出来的蛋白的质量?PPARγ做过吗？
老师觉得AP显色怎么样
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发表于 2013-2-21 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从组织提的蛋白，分子量52kd，上样量60ug，80v，120v电泳，400mA 10v 28min半干转，5%脱脂奶粉37度摇床封闭1小时，一抗 1：500 1%脱脂奶粉稀释（5%脱脂奶粉200+800TBST） 4°C孵过夜，国产二抗1：1000（已经做出来蛋白的条件），现在做的是相同的蛋白不同的组织。 37度摇床1小时。TBST洗膜3*10min（2抗后洗6*15min）。发光剂是碧云天ECL PLUS。
一抗 1：500 无条带
一抗 1：300 有的孔道有条带 有些没有
做内参1：100到1：400 （效价低）也是同样的问题
染色后孔道都有清晰的带 分开的不错（就是带很细）
请问fangweibin119
可能是那里出问题了？ 该如何解决

==============================

加大上样量
内参抗体这么低的效价怎么往下做啊
内参抗体用量大
建议买其他厂家的
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发表于 2013-2-21 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的基因是核蛋白可以提总蛋白做出来吗，怎么检测提出来的蛋白的质量?PPARγ做过吗？
老师觉得AP显色怎么样

=============================

我做的是PPAR-1 cleaved25蛋白
AP显色敏感性低
建议提取核蛋白
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教版主各百分比的胶的配方，谢谢.
又：我跑胶时marker的第一条带老是看不见，是什么原因呢？
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发表于 2013-2-21 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我加大以一下抗体浓度就出来带拉哈哈tubulin可能是效价较低，我用到1：100，二抗改为1：500，一抗过夜就OK拉。呵呵谢谢版主哦
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发表于 2013-2-21 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
碧云天的ECL plus 太强了，我建议你换一种了。我也用的碧云天的ECL plus 试用版，实在是太强了，把背景弄的很深，看不清楚目的条带~
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教！为什么我的片子上会有这么多点点状的脏东西？同一张膜使用别的抗体和二抗曝出来都是没有问题，条带很清晰的。


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发表于 2013-2-21 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
碧云天的ECL plus 太强了，我建议你换一种了。我也用的碧云天的ECL plus 试用版，实在是太强了，把背景弄的很深，看不清楚目的条带~

==================

呵呵
你建议我换一种吗？
弄糊涂了
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发表于 2013-2-21 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是一抗的问题
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-2-21 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做Western Blot结果不稳定（有时有条带有时没得，背景时好时坏），现在我在想到底是抗体的原因还是转膜的原因；因为回想这一个月十几次Western Blot，我注意到我恒压转膜对应电流状态好时有180mA，然后掉到150mA（转膜10min的样子），或者是150mA然后120mA，最近150mA然后60或70mA（都是转膜10min左右后的变化）。有次试着用恒流转膜（200mA），对应电压大概180-190V的样子，结果转膜Marker条带非常不清晰，用丽春红染色后只见泳道不见蛋白条带。
现在兄弟很抓狂，不知如何分析改进？
请教了实验室的能人，建议重配转膜液和换转膜的装置；我转膜液前后已配了4，5次，装置也用的是实验室公用的，所以很迷茫。望不吝赐教！
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