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标题:【讨论帖】western blot问题解答

yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-2-22 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
变性后，上样之前短暂离心，取上清电泳
（蛋白浓度多大？）

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版主您好！想向您请教一下具体的原理？因为我们实验室常规在电泳之前都要震荡混匀，我很困惑2种方法哪个对？谢谢！
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-2-22 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用楼主的湿转条件300mA，90mins，转膜很成功！
上样量10微克蛋白，组织中提取的蛋白！做出来的内参如图！
但是目的蛋白有两个孔有很淡的条带！其余孔没有条带！是上样量太少了吗？要加大上样量或是增加目的蛋白抗体的浓度，这次目的蛋白一抗为1：1000；
进暗室曝光时，根本看不到条带，所以内参和目的蛋白一起共曝了10分钟！可结果竟然有条带！搞不懂为什么？


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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-2-22 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面是目的蛋白，曝光时内参和目的蛋白没有对齐，目的蛋白应该再向右一点的，这样就和内参对应上了。内参一抗：1：2000；目的蛋白一抗：1：1000（推荐浓度）；二抗：1：10000


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mickeylin[使用道具]
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发表于 2013-2-22 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
溴酚蓝在分离胶中跑到下半部会弥散

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但是有时是可以压成一条线的？会不会跟Tris-HCL的pH有关系呢？
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-2-22 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验进展不好，84，91目的条带有。但内参和25，46的条带无论如何出不来。
标本量有限，增大上样量已不可能，应该怎么办？
用的抗体是CELLSIGNAL的。一抗推荐1：1000不变
二抗1：1000-3000
是哪里出了问题？
能给个解决问题的思路么
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发表于 2013-2-22 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我想问一个问题：
我在转膜的时候如果一个转膜槽中转两块胶的话，那么靠近负极的那板老是转不好，就是像被水冲散了一样，是怎么一回事呢？
请帮忙回答，谢谢。
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发表于 2013-2-22 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1，具体的东西在网上你可以搜一下，有很多
2，ECL敏感性高会有非特异性条带产生

请问怎么样才能降低因为ECL敏感性高而产生的非特异性条带呢？

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1，换用敏感性低的ECL
2，降低一抗、二抗的浓度
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发表于 2013-2-22 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主您好！想向您请教一下具体的原理？因为我们实验室常规在电泳之前都要震荡混匀，我很困惑2种方法哪个对？谢谢！

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SDS容易有沉淀，融化之后混匀
然后离心把杂志去掉
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H2O[使用道具]
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 小中大
我用楼主的湿转条件300mA，90mins，转膜很成功！
上样量10微克蛋白，组织中提取的蛋白！做出来的内参如图！
但是目的蛋白有两个孔有很淡的条带！其余孔没有条带！是上样量太少了吗？要加大上样量或是增加目的蛋白抗体的浓度，这次目的蛋白一抗为1：1000；
进暗室曝光时，根本看不到条带，所以内参和目的蛋白一起共曝了10分钟！可结果竟然有条带！搞不懂为什么？

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应该在暗室加ECL
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H2O[使用道具]
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发表于 2013-2-22 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是有时是可以压成一条线的？会不会跟Tris-HCL的pH有关系呢？

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样品缓冲液用的是6.8
电泳缓冲液一般是8.3
应该没问题
另外不要注意这个，而要注意染胶及转膜后染膜结果
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