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标题:【讨论帖】western blot问题解答

PINK[使用道具]
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非常感谢版主发布这个帖子,我正好最近准备做Weasternblot,在做之前想把问题及细节尽量弄清楚,尽量少走弯路。
我们这边实验室做Westernblot的技术不是很成熟,就是转膜经常转不上,用内参之后膜上经常都是什么也没有,是不是这边的转膜电压,电泳液及转膜液出了问题,或是转膜的方法不对,请教版主,请版主告知详细的操作步骤及配液方法,越详细越好,十分感谢!
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hyuu[使用道具]
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建议用BCA来定量
定量后用蛋白抽提试剂与loading buffer把蛋白调整至浓度一致再上样
等体积

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谢谢您的帮助,可是我有个不明白的地方。蛋白抽提试剂是什么啊。我的loadingbuffer是2倍的。难道不是提取的200微升的蛋白就加200微升的buffer么。这个怎么把蛋白浓度调一致啊。。用一倍的loading buffer稀释弄的蛋白么?这样把浓度调一致?我用的裂解液RIPA提的组织蛋白。浓度调一致后再煮沸?然后就可以上样?
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我的一抗要求用PBS稀释,我可以用TBS稀释吗?还有,PBS怎么配?谢谢!
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谢谢您的帮助,可是我有个不明白的地方。蛋白抽提试剂是什么啊。我的loadingbuffer是2倍的。难道不是提取的200微升的蛋白就加200微升的buffer么。这个怎么把蛋白浓度调一致啊。。用一倍的loading buffer稀释弄的蛋白么?这样把浓度调一致?我用的裂解液RIPA提的组织蛋白。浓度调一致后再煮沸?然后就可以上样?

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1,蛋白抽提试剂就是你的裂解液(lysis buffer or extraction buffer)
2,计算好蛋白浓度,比如10mg/ml,我要调整至终浓度为2mg/ml
那么你可以取10ul 10mg/ml样品+ 15ul lysis buffer + 25ul 2倍loading,终浓度为2mg/ml,变性后电泳(如果换用5倍loading算法请自己去琢磨)
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NBA[使用道具]
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我的一抗要求用PBS稀释,我可以用TBS稀释吗?还有,PBS怎么配?谢谢!

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PBS及TBS稀释均可
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PINK[使用道具]
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请问楼主我做小分子量目的蛋白分子量10kd,请那个公司的蛋白marker比较好?推荐一下
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zsxan1990[使用道具]
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版主你好:我用蛋白MIX摸条件好好的,结果上样却没有条带,我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀?谢谢
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kuaizige[使用道具]
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大家好!我是新手 第一次做western 为什么我的内参还出现两条条带啊
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yapuyapu[使用道具]
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我是新手!近期做Westernblot老不出结果!我的蛋白是68kd,用的条件是80V稳压,2h,转膜后,一抗和二抗孵育了,显色后,不出结果!怎么回事?
后来有改变条件,稳流200mA,3h,结果还是一样,仍旧不出结果!各位大侠 到底咋回事呢?请指教一下!
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u234[使用道具]
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谢谢您!明白了!呵呵!又增长知识了!~~但是。还有个小问题。。用裂解液稀释蛋白的时候,裂解液里需要另外再加PMSF么。。所说的蛋白抽提试剂是加了蛋白酶抑制剂的裂解液么?还是纯粹的ripa?
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