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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-23 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主我做小分子量目的蛋白分子量10kd,请那个公司的蛋白marker比较好？推荐一下

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Fermentas #SM1891
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发表于 2013-2-23 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好：我用蛋白MIX摸条件好好的，结果上样却没有条带，我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀？谢谢

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蛋白MIX是什么意思？
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发表于 2013-2-23 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好！我是新手 第一次做western 为什么我的内参还出现两条条带啊

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1，一抗浓度太高
2，一抗特异性不好
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发表于 2013-2-23 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是新手！近期做Westernblot老不出结果！我的蛋白是68kd，用的条件是80V稳压，2h，转膜后，一抗和二抗孵育了，显色后，不出结果！怎么回事？
后来有改变条件，稳流200mA，3h，结果还是一样，仍旧不出结果！各位大侠 到底咋回事呢？请指教一下！

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呵呵
问题说的太简单了
WB是个系统，任何一个环节有问题都可能影响最后结果
转膜后你用丽春红染膜了吗？
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发表于 2013-2-23 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢您！明白了！呵呵！又增长知识了！~~但是。还有个小问题。。用裂解液稀释蛋白的时候，裂解液里需要另外再加PMSF么。。所说的蛋白抽提试剂是加了蛋白酶抑制剂的裂解液么？还是纯粹的ripa?

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调整蛋白的浓度的时候我不加PMSF
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发表于 2013-2-23 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，我最近配胶，分离胶凝固之后上界面总是出现密密的锯齿，偶尔会正常，我每次都拼命混匀，玻璃板也都反复洗干净，一直找不到原因，非常苦恼。考虑过试剂的问题，但是实验室有人用同样的试剂就不会出现这个问题，现在配胶都有心理阴影了。
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发表于 2013-2-23 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还要咨询一个问题，因为我们实验室没有封口机，所以一抗用的很费，有没有好办法能够省一抗呢？非常感谢！
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发表于 2013-2-23 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做兔肌球蛋白的WB，分子量在200KD左右，一抗选的MILLIPORE的Anti-Myosin Heavy Chain,Clone,二抗选的碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG。选择β-actin作为内参合适不？操作上具体怎么做比较好？还有没有什么需要注意的？
恳请熟悉的朋友赐教！谢谢！
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发表于 2013-2-23 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，我最近配胶，分离胶凝固之后上界面总是出现密密的锯齿，偶尔会正常，我每次都拼命混匀，玻璃板也都反复洗干净，一直找不到原因，非常苦恼。考虑过试剂的问题，但是实验室有人用同样的试剂就不会出现这个问题，现在配胶都有心理阴影了。

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那就看看人家配胶时的手法
你用饱和异丁醇封胶试试
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发表于 2013-2-23 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还要咨询一个问题，因为我们实验室没有封口机，所以一抗用的很费，有没有好办法能够省一抗呢？非常感谢！

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不知道你的膜有多大
这个问题打字说不清楚
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