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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-23 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做兔肌球蛋白的WB，分子量在200KD左右，一抗选的MILLIPORE的Anti-Myosin Heavy Chain,Clone,二抗选的碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG。选择β-actin作为内参合适不？操作上具体怎么做比较好？还有没有什么需要注意的？
恳请熟悉的朋友赐教！谢谢！

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你算问对人了
MHC所有亚型我都做过
不知道你的电泳槽是什么型号，分离胶能有多高
通过其他方式联系
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-2-23 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好：我用蛋白MIX摸条件好好的，结果上样却没有条带，我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀？谢谢

蛋白MIX是什么意思？

所有样品按等浓度混合摸条件
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发表于 2013-2-23 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢。以后还有不懂再问。反正我做的现在做的我快不行了。熬不住了总是很难看。。要么就不出。恩。谢谢您，以后再向您请教
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-2-23 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主你好！我最近几次WB出现蛋白在浓缩胶内不能压缩成细条带，溴酚蓝到底后，考马斯亮蓝染胶发现分离胶内没有条带，沿着泳道都是浅蓝色的，但是同一块胶内其他人的样品是好的，可以染出条带的。所有提蛋白和电泳的条件都一样，只是loading buffer是新配制的，我怀疑是这个的问题，重新配制了一次还是出现同样的问题，我配的是5×的buffer，按下面的配方配的1 M Tris·Cl (pH 6.8) 1.25 ml，SDS （电泳级） 0.5 g，溴酚蓝（BPB） 25 mg，甘油 2.5 ml，用前加25ul 2-ME ,崩溃中。麻烦您帮我分析下要怎么改进
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发表于 2013-2-23 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好！我最近几次WB出现蛋白在浓缩胶内不能压缩成细条带，溴酚蓝到底后，考马斯亮蓝染胶发现分离胶内没有条带，沿着泳道都是浅蓝色的，但是同一块胶内其他人的样品是好的，可以染出条带的。所有提蛋白和电泳的条件都一样，只是loading buffer是新配制的，我怀疑是这个的问题，重新配制了一次还是出现同样的问题，我配的是5×的buffer，按下面的配方配的1 M Tris·Cl (pH 6.8) 1.25 ml，SDS （电泳级） 0.5 g，溴酚蓝（BPB） 25 mg，甘油 2.5 ml，用前加25ul 2-ME ,崩溃中。麻烦您帮我分析下要怎么改进

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用他的loading试试
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发表于 2013-2-23 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好：我用蛋白MIX摸条件好好的，结果上样却没有条带，我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀？谢谢

蛋白MIX是什么意思？

所有样品按等浓度混合摸条件

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问题很多
也就是说整个系统我现在不知道你在什么地方出现了问题
你说的太简单了
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发表于 2013-2-23 12:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问下做磷酸化的抗体是不是不能用脱脂奶粉封闭？用BSA封闭么？
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发表于 2013-2-23 12:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我用western blotting检测内皮细胞tie-2（酪氨酸蛋白激酶受体）表达，按照抗体说明书其分子量应在145KD，但我的条带在72KD，请您帮我分析这是什么原因，我的实验过程大概是：用RIPA强裂解液（加入1mM PMSF作为蛋白酶抑制剂）裂解，130000rpm离心15min，收集上清，蛋白定量，用6％分离胶电泳，然后转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，加一抗（santa，1：500），4度过夜，用PBST洗3次，PBS洗两次，加二抗（santa，1：5000），室温2h，洗涤，加发光试剂，曝光，显影，定影。
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发表于 2013-2-23 12:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问下做磷酸化的抗体是不是不能用脱脂奶粉封闭？用BSA封闭么？

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有用奶粉做磷酸化蛋白的
但是建议你用BSA
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发表于 2013-2-23 12:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我用western blotting检测内皮细胞tie-2（酪氨酸蛋白激酶受体）表达，按照抗体说明书其分子量应在145KD，但我的条带在72KD，请您帮我分析这是什么原因，我的实验过程大概是：用RIPA强裂解液（加入1mM PMSF作为蛋白酶抑制剂）裂解，130000rpm离心15min，收集上清，蛋白定量，用6％分离胶电泳，然后转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，加一抗（santa，1：500），4度过夜，用PBST洗3次，PBS洗两次，加二抗（santa，1：5000），室温2h，洗涤，加发光试剂，曝光，显影，定影。

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你这个蛋白是二聚体吗？
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