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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-23 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用梯度胶

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版主您好！我W没有多久，弱弱的问一下梯度胶在什么情况下使用？怎么配呢？因为我之前没有听过，见笑！谢谢！
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发表于 2013-2-23 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我做wb上样是一个总蛋白，一个Co-IP蛋白，还有一个总蛋白，前两个用我们的特定一抗，后面用actin抗体。转膜后用丽春红染有条带，ECL显影，IP结果和actin有明显清晰条带，就是总蛋白的没显影，这是什么原因呢？PS：IP是用我们的特定一抗。
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发表于 2013-2-23 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好！我在做P53，WB出来的结果很不好，有的跑出3条带，其中有一条是60左右，一条53左右，但所有的细胞都跑出了40左右的条带，这是怎么回事？一抗是用的santa cruz p53 (Pab 1801)二抗是goat anti-mouse.谢谢！
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发表于 2013-2-23 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

之前我也有过关于裂解液的困惑。小了解了一下，仅供参考。根据变构剂强弱及成分的相互作用裂解液大致分为弱、中、强效。您讲的这个配方好像是中效的。建议您可以在碧云天的网站查询各种裂解液，有配方的对比，可能有所帮助。希望有用！

碧云天也没有1*PBS的裂解液呀
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2013-2-23 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

碧云天也没有1*PBS的裂解液呀

cuturl('http://www.beyotime.com/lysis-buffer.htm')。个人认为选择的关键是变构剂，是不是不必太注意PBS呢，按照常规配方吧。看看这个网址的链接，是碧云天的，希望有用吧！
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发表于 2013-2-23 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室原来是配裂解液的，现在也买碧云天的了，不贵，方便些。我个人认为蛋白提取很关键的一步。仅供参考！
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-2-23 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室原来是配裂解液的，现在也买碧云天的了，不贵，方便些。我个人认为蛋白提取很关键的一步。仅供参考！

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能不能讲下你提单白的一些经验和操作。谢谢
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-2-23 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问,我做的蛋白分别是25kd、38kd和43kd的，之前做的除了操作上不够严谨，显影后条带不是很均匀外，其他问题不大，条带颜色较浓，背景没有明显的颜色和杂带
但从某一天开始，试剂、抗体、试验条件均未更改，就什么都做不出来
重新配抗体、重新购买抗体均不能做出来，连内参也没有一点条带
试验设备应该没有问题，使用同一套设备的同学能做出来
这样大概已经有2个星期了，很急，请教能不能帮我分析一下原因
我的实验条件是：
从组织提的蛋白，上样，70v，100v电泳
0.2PVDF膜Bio-rad半干转1mA/cm2 60-65分钟
5%脱脂奶粉室温封闭1小时
santa一抗 1：400，TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜或室温摇3小时，TBST洗膜3*10min
碧云天二抗1：1000TBST稀释（推荐1：1000）室温80分钟,TBST洗膜3*10min
发光剂是碧云天ECL，从来没有看到过任何荧光，之前做的压片5分钟条带明显，现在第一次压片就压20分钟，什么都没有
恳请帮忙~~~多谢
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发表于 2013-2-23 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

因为是刚开始想摸条件，便做了B-actin，分子量42kd。用的是六一厂的湿性转膜仪。
转摸条件：4摄氏度、35mA、2小时。（胶大小约6.0*2.5cm）
一抗：1：100 5%脱脂奶粉稀释的（说明书建议1:100--1:1000）
二抗：1：1000 TBST稀释的（说明书建议1:1000--1:3000）
用的是ECL发光，但是暗室里在已与ECL充分作用的PVDF上却没有见到荧光，胶片上无任何条带。
补充：转完膜后，PVDF膜上可见到MARKER的印迹，二抗单独与ECL作用也可见到荧光。
请问楼主是哪个环节出了问题？（是膜的问题、还是膜上没有转上去蛋白、还是一抗与膜上的蛋白未结合，还是二抗与一抗不结合）
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ukonptp[使用道具]
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 小中大

请教一下版主
我一抗加叠氮钠记错浓度；
把0.02%的叠氮钠加成0.2%
请问对实验有何影响？
有没有什么补救措施？
谢谢！
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