蛋白质与蛋白组学

两个小时，这样用样品的混合蛋白按10，20，40，80微克，ECL显色，胶片曝光有条带而且蛋白量不同条带有明显的区别，然后我用同样的条件做单个的样品按40微克上样，结果没有看到荧光条带而且胶片曝光也没有条带，我重复多次都一样，而且染膜能看见膜上有很多条带，染胶无条带。我晕掉了，这可能是什么原因？谢谢

这样的问题我也不知道
第一次你有结果，说明操作你没有问题
建议你仔细找找缓冲液等的问题

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

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裂解液有很多种啊
还有只有1% NP-40的配方
因此我认为这个不是主要原因

两个小时，这样用样品的混合蛋白按10，20，40，80微克，ECL显色，胶片曝光有条带而且蛋白量不同条带有明显的区别，然后我用同样的条件做单个的样品按40微克上样，结果没有看到荧光条带而且胶片曝光也没有条带，我重复多次都一样，而且染膜能看见膜上有很多条带，染胶无条带。我晕掉了，这可能是什么原因？谢谢

这样的问题我也不知道
第一次你有结果，说明操作你没有问题
建议你仔细找找缓冲液等的问题

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

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关于裂解液问题：我现在可以提供总蛋白裂解液，胞浆胞核蛋白裂解液，还有stripping buffer

版主您好！我W没有多久，弱弱的问一下梯度胶在什么情况下使用？怎么配呢？因为我之前没有听过，见笑！谢谢！

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做大分子量蛋白
同时还想保留内参
配制需要梯度混匀仪（也叫梯度混合器）
蠕动泵
磁力搅拌器
怎么配你可以参考Biorad的说明书或者《蛋白质技术手册》

您好！我在做P53，WB出来的结果很不好，有的跑出3条带，其中有一条是60左右，一条53左右，但所有的细胞都跑出了40左右的条带，这是怎么回事？一抗是用的santa cruz p53 (Pab 1801)二抗是goat anti-mouse.谢谢！

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你试试Epitomics的p53抗体
效果很好

请问,我做的蛋白分别是25kd、38kd和43kd的，之前做的除了操作上不够严谨，显影后条带不是很均匀外，其他问题不大，条带颜色较浓，背景没有明显的颜色和杂带
但从某一天开始，试剂、抗体、试验条件均未更改，就什么都做不出来
重新配抗体、重新购买抗体均不能做出来，连内参也没有一点条带
试验设备应该没有问题，使用同一套设备的同学能做出来
这样大概已经有2个星期了，很急，请教能不能帮我分析一下原因
我的实验条件是：
从组织提的蛋白，上样，70v，100v电泳
0.2PVDF膜Bio-rad半干转1mA/cm2 60-65分钟
5%脱脂奶粉室温封闭1小时
santa一抗 1：400，TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜或室温摇3小时，TBST洗膜3*10min
碧云天二抗1：1000TBST稀释（推荐1：1000）室温80分钟,TBST洗膜3*10min
发光剂是碧云天ECL，从来没有看到过任何荧光，之前做的压片5分钟条带明显，现在第一次压片就压20分钟，什么都没有
恳请帮忙~~~多谢

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问题不好判断
中间换过什么试剂没有？

因为是刚开始想摸条件，便做了B-actin，分子量42kd。用的是六一厂的湿性转膜仪。
转摸条件：4摄氏度、35mA、2小时。（胶大小约6.0*2.5cm）
一抗：1：100 5%脱脂奶粉稀释的（说明书建议1:100--1:1000）
二抗：1：1000 TBST稀释的（说明书建议1:1000--1:3000）
用的是ECL发光，但是暗室里在已与ECL充分作用的PVDF上却没有见到荧光，胶片上无任何条带。
补充：转完膜后，PVDF膜上可见到MARKER的印迹，二抗单独与ECL作用也可见到荧光。
请问楼主是哪个环节出了问题？（是膜的问题、还是膜上没有转上去蛋白、还是一抗与膜上的蛋白未结合，还是二抗与一抗不结合）

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转膜后检测过膜上是否转上蛋白了吗

斑竹，前不久我们交流过WB做骨骼肌肌球蛋白重链MHC亚型的话题。现在，我发觉好象很难寻觅到可以分出MHC-I，MHC-IIa和MHC-IIb条带的一抗。不少公司都问到这3个蛋白亚型的分子量的问题，但好象文献中只笼统的说到200-220Kd。下一步，不知道该怎么办了。请您在指导一下。谢谢1

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这三个亚型本来就很难分辨
可以用银染来做MHC的分型
电泳要跑几十个小时吧才能分出来
抗体只有I与II