蛋白质与蛋白组学

我没染胶。。只染了膜。丽春红染的。有条带。，但是一个孔道只有一条。丽春红染色该是非特异的条带吧，就这个孔，只有一条，就一条，横的一条，其他的还有竖的宽电泳跑道，这个孔没有。其他的三个都有明显的竖的跑道，但是ACTIN就一个孔有，不是这个只有一条的孔。。这个是样品问题么？我提的样品还测了浓度的。。。

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兄弟
电泳就有问题
你是纯化后的蛋白样品电泳？
如果是总蛋白不可能只是一条带啊
先把电泳跑好吧

老师你好！

请教一下：我的目的蛋白，分子量88kD左右，分别于28，18℃诱导，裂解细胞提取上清和沉淀蛋白。
10%SDS-page，转膜恒流200mA，1.5h
5%脱脂奶粉封闭1h，一抗稀释，4℃过夜。二抗稀释1：5000，常温1.5h。

结果是marker染色了，分别是75KD和100KD，1道和4道都是mark，同样。
空白对照(BL21，Ecoli)应该没有目的条带，结果却显示清晰地一条，且和实验组的相同。

是什么原因？封闭时间不够？还是膜没有洗干净？还是其它？

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是不是应该检查你的诱导条件？
另外一抗再稀释下

老师，你好！
我最近做WB都遇到几个很苦恼的问题，请老师指教
1、几次跑电泳时到溴酚蓝距低端约2cm时几个胶道就跑成曲线了，电泳时间也很久，总共快4个小时
2、溴酚蓝弥散比较严重，条带很不好
3、有次marker在浓缩胶就分离了
4、之前怀疑电泳缓冲液的问题，今天换了新的缓冲液，还是跑斜了，并且marker跑成两个驼峰一样的，溴酚蓝弥散也比较明显，似乎也成驼峰状。今天用的缓冲液体系是，15gTris碱，72g甘氨酸，5gSDS，溶解于1L去离子水，用时稀释为1*。浓缩胶5%，分离胶12%。
图片是我之前做的一次跑斜了的，上面是目的蛋白17kd，下面是Actin，只有前半部分减到了。另一个目的蛋白P53和marker相差10kd以上，没减到。
急，请老师指教可能的原因，谢谢！

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1，是不是拔梳子时把浓缩胶与分离胶给弄分离了？
2，分离胶聚合不好，可以4度聚合过夜
3，胶底部有气泡，但是有气泡不会成这个样子
4，P53很好做，提取蛋白也没什么难度
5，另外是不是你的实验台斜了啊
其他的我没见你操作就不知道了

是不是应该检查你的诱导条件？
另外一抗再稀释下

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谢谢老师，我是WB得新手，想再请教一下
1我现在一抗是1：2000，已经是说明书上最大的建议浓度了，建议稀释多少？
2 marker是不该染色的，我的却有条带显示，是一抗的原因吗？想不通啊

谢谢版主，今天我又跑了。。跑个梯度。。看看效果怎么样。从跑的样子看。。还不错哦。。嘿嘿。。等待明天的曝光结果。今天等下还要曝光昨天做的。。也许。。会有转机。。我快不行了。。。

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跑的样子？
转膜后染膜观察转膜效果吧

谢谢老师，我是WB得新手，想再请教一下
1我现在一抗是1：2000，已经是说明书上最大的建议浓度了，建议稀释多少？
2 marker是不该染色的，我的却有条带显示，是一抗的原因吗？想不通啊

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Marker也是蛋白，有很多是重组蛋白，带着标签
与你的抗体有反应很正常啊
1：4000稀释试试

LZ.你好，刚开始做WESTERN，遇到的问题是这样的，提取内皮细胞的蛋白，测浓度符合WESTERN要求，上样为20vl，蛋白含量40vg，结果跑了3次了，总是marker跑得很好，考马斯亮蓝染胶没有任何条带，一直找不出原因。很急！恳请楼主帮忙分析一下！谢谢！

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那你有没有考虑蛋白浓度测试时有问题？
建议用别人的样品跑一次电泳试试
然后确认是不是你的蛋白没有提取出来