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标题:【讨论帖】western blot问题解答

pencil菲[使用道具]
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发表于 2013-2-23 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近跑电泳的图像已经发到您的邮箱。126的，谢谢帮忙看下又没什么问题
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发表于 2013-2-23 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问做western-blot时，目的蛋白是胞外蛋白，内参用什么比较合适？胞内的可以吗？谢谢。

===============================

你做组织还是细胞啊？
如果做组织的话可以选择胞内的内参
另外建议你参考文献上所说
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发表于 2013-2-23 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主：有做过人FSH（约30K）的WB吗？

我最近在做，
用恒压80V 2h转（电流约200mA,跟温度有关啊）
一抗santa,1:150
二抗：invitrogen 1:10000
GE ECL显影

结果：目的蛋白处没有任何条带

但Marker 有清晰条带，

请问我该如何改进？

谢谢！
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发表于 2013-2-23 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主：有做过人FSH（约30K）的WB吗？

我最近在做，
用恒压80V 2h转（电流约200mA,跟温度有关啊）
一抗santa,1:150
二抗：invitrogen 1:10000
GE ECL显影

结果：目的蛋白处没有任何条带

但Marker 有清晰条带，

请问我该如何改进？

谢谢！

======================

你这个蛋白是分泌型的蛋白
做组织来源的还是细胞？
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-2-23 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，请问一下：
我做的是ps1,28kd左右，刚开始几次用牛奶封闭（光明脱脂奶）做不出来，后来该用1%bsa封闭居然做出来（虽然同时加大了上样量），只是非特异带太多，看园子里战友都说两者封闭效果差不多，于是在接下来的几次里再次改用牛奶封闭（bsa太贵，而且杂带确实很多），而且上样量>=上次做出来的上样量，其他条件都没有变过。但都没有做出来，直接一片空白，
我真的想知道bsa或牛奶封闭在能不能做出来这方面起到这么大的决定作用？
谢谢！
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发表于 2013-2-23 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，我做得wb内参都出来了，目的条带有得泳道有有的泳道没有，按说应该都有的，内参都出来了，应该可以排除提蛋白得问题，我这个蛋白是提取得组织的蛋白，组织的这种目的蛋白含量应该不低得，提取过程也没什么问题得，想请教下这个可能得原因？多谢！！！
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发表于 2013-2-23 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我现在在做cleaved-caspase-3的WB，可是已经做了好几次了，每次都是白板，希望fangweibin119老师帮帮我，以下是我跑WB的条件:

1 膜是0.45um,电转时间120min
2 15%和10%的胶都试过
3 一抗是cell signaling 公司的，浓度为1：500，二抗是中衫的，1：2000，封闭液5%的奶粉
谢谢!
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发表于 2013-2-23 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我现在在做cleaved-caspase-3的WB，可是已经做了好几次了，每次都是白板，希望fangweibin119老师帮帮我，以下是我跑WB的条件:

1 膜是0.45um,电转时间120min
2 15%和10%的胶都试过
3 一抗是cell signaling 公司的，浓度为1：500，二抗是中衫的，1：2000，封闭液5%的奶粉
谢谢!

我觉得可能原因：１．你的蛋白没有被激活，因为你做的是cleaved-caspase-3，需要caspase-３被激活才可以；２．蛋白上样量少了；３．ＥＣＬ问题；４．转膜问题；５．其他
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发表于 2013-2-23 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问大侠，NC膜和PVDF膜怎么使用，您能详细给我解答吗，谢谢！
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qqq111[使用道具]
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发表于 2013-2-23 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哪位能给我解释一下：在做wb时，上样量、一抗浓度、二抗浓度、ecl发光液之间的量的关系。这四者之间到底有没有关系？怎样的关系？我现在怀疑上样量过大会造成：wb的结果是空白的片子。
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