蛋白质与蛋白组学

一个尿液里提纯的，0.2mg/ml
还有就是基因工程的了，CHO分泌的

转膜的条件合适吗？

一抗会不与变性的蛋白反应吗？（如果原来做抗体的蛋白分子量与我的目的蛋白不用，因糖基化程度不同，会影响我的蛋白跟这个抗体结合？）

谢谢！

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一般的WB抗原都是变性的，所以说大部分情况下是识别的

你好，版主，问一个问题：我上样量一样，但是跑出来的条带怎么有粗有细，粗的不好看而且还很模糊。怎么样才能让其变得很细且很清晰。
我附图如下：

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1，转膜时有气泡
2，孵育抗体时部分没有孵育好
3，ECL孵育是否完全

大家好，我刚开始做wb，我从细胞中提的蛋白，我是从视网膜色素细胞（rpe）中提取的蛋白，浓度大概在10ug/ul以上，上了20ul，100v，120v电泳，转膜前，pvdf在甲醇中泡10min，然后和滤纸，垫片，一起在转膜缓冲液中泡30min，100v，100min湿转，转后在pvdf上可以看到mark的痕迹，其它没有痕迹。没有立春红染色。但是同跑的一块胶我做了考马斯染色，有条带的。5%脱脂奶粉TBST室温封闭1小时，santa一抗 1：200TBST稀释（推荐1：200-1：1000）4°C孵过夜，tbst 3*10min，国产二抗1：5000TBST稀释（推荐1：5000-1：10000）室温1+小时。都是TBST洗膜4*15min。
发光剂是国产ECL。暗室曝光2min，（我的膜用两层保鲜膜包裹，正反面用两张x胶片，用手压住2min），显影1min，定影出来都是黑色的胶片，似乎没有任何信号，我不知道原因。请高手赐教！！！
那我现在能不能这样做：膜我放在4度冰箱，拿出来用tbst洗3遍，再用二抗孵育，再用ecl，显影，定影。

这样可以么？

还有就是我买了康成的HRP标记的gapdh，请问这内参什么时候加入啊？

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胶片曝光了，暗室中不是很暗吧

我用手电筒，外面罩了个红色塑料袋~~~条件简陋啊

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把红色塑料袋换一下
你这张胶片就是被整体曝光了

版主你好！
我提的蛋白的浓度比较低，只有1.6mg/ml，上样的时候能不能少上一些啊？像我这种情况，在保证实验结果的前提下，多少合适啊？麻烦了

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不知道你要做什么蛋白
加上5倍loading后浓度就是：1.28了
上样孔一般能上25ul
如果蛋白丰度可以的话上20ug~30ug就够了

版主你好！我做WB时要做370KDa的ATM，没法跟别的抗原分子量很小的蛋白一块电泳和转膜，像这样的蛋白，电泳时间（100V,60mA)和转模时间，一般设在多少为宜？谢谢了

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不知道你有没有梯度胶
如果没有的话不知道你有没有中型电泳槽（分离胶高度达到10cm，参考六一厂 DYCZ-24EN）
小型电泳槽没法同时把目的蛋白及内参都保留在膜上一起杂交
小分子量的蛋白只能再跑一次电泳来确定
你的这个蛋白是核蛋白
需要用胞浆、胞核蛋白抽提试剂盒来提取（不明白的地方站内信息联系）