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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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SDS-PAGE之后,胶经过了考马斯亮蓝染色和甲醇脱色后,这块胶还能不能用于转膜后做WB?
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膜上的最右边是普通marker,中间最粗的是40,下面是30、24.
我的疑问:
1,好像曝光出来的带就是膜上的蛋白带,但是我的目的蛋白是膜蛋白,丰度不会那么高,请问片子上30多的主带是不是目的蛋白?
2,为什么会有那么多杂带?
3,第一种亚型的分子量是上面所说的,第二种和第三种要比第一种小2-4KD,那在片中两道明显的主带却不见有差别。
4,第二道的marker为显影可见的,以前爆出来过清晰的几条带,可是这把为什么乱七八糟?
5,第一道保护孔里没上蛋白,也没有溢进去蛋白,为什么还有带?
6,AQP4文献一般说32-34kD,为什么一抗的说明书说他们产品显得是38kD?
7,我这个预染marker的有些条带我感觉不准,跟别人的marker一起跑不一致,是否marker市场存在这样的问题?请您推荐一款准确的marker产品。
请解答,多谢!

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1、转染的细胞应该有特异性表达的条带,如染膜所示,会有条带较粗的情况
2、杂带问题与抗体有关,抗体质量、稀释度调整等
3、抗体是不是重复使用了?marker的显影与曝光时间、一抗、二抗等有关
4、marker中的蛋白影响了边上的泳道
5、不同厂家的说明是不一样的
6,预染marker肯定不准啊,需要通过预实验预染marker与非预染marker染胶后确定分子量位置,预染marker是转膜及电泳时的一个可见标志
7、30多的主带应该是目的蛋白
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另一个案例:鼠脑提的蛋白(-20中存放较长时间的),还是做AQP4,没有曝出带,后染膜发现蛋白带很不清晰,模糊成一团,如图,请问是什么原因导致条带不清晰?这是暴不出带的只要原因吗?

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这个组织提取蛋白电泳存在很大问题
条带模糊,请先把电泳跑好
但是你上次细胞的那个蛋白条带还行
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我刚刚做这个,请问一下一抗和二抗的稀释度应该怎么估算啊,今天做了一次,一抗是小鼠腹水,1:5000稀释的,二抗1:8000稀释的,每次都洗了很久,但是结果背景颜色很黑,是怎么回事啊

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1、确定二抗稀释度与ECL的敏感性,也可以说是两者的合适比例问题
在NC膜上点膜确定二抗的稀释度,可参考我的其他帖子,不细说了
2、确定二抗后再做几个一抗的稀释度,如果有ELISA结果,那么稀释度可以除以10或者100来做WB的稀释度
3、背景与封闭、抗体、腹水质量有关
4、你的这个背景是什么意思?是胶片整体发黑还是在有膜的那一块发黑?
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请教一个关于凝胶配制的问题。
通常情况下,都是配的30% Acr/bic(29:1),碧云天里还有出售40% Acr/bic(39:1)。不知道这2者之间的区别是什么?我参考到一些文献,有把Acr与bic的比值提高到50:1,那他们的质量分数该是多少呢?还是30%么?即能不能按30% Acr/bic(50:1)配?

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可以按30% Acr/bic(50:1)配
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我的19KD蛋白,该怎么转膜啊,bio-rad湿转

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300mA 恒流 20min
0.22um膜
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你好。我在做WB时条带是这样子的(条带不连续)。请你帮我分析一下。

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1,抗体孵育
2,转膜没有转好,膜与胶可能有挪动等
3,请先电泳染胶看蛋白条带
4,转膜后丽春红等染色看转膜效果再行后续步骤
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上面的这个是我的最终的目的,一共是六个,但是奇怪的是中间的一个条带没有出来,可能是什么原因呢?

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1,转膜后用丽春红等染色证明转膜效果没问题
2,注意抗体孵育时膜是不是全部在液体中
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请问一下我的试验有何问题??谢谢
转膜用GE按玛西亚半湿转印仪,400mA 1h,能看到预染marker已转上,然后封闭过夜(封闭液为1%的BSA,用PBS配制),然后PBST漂洗三次,然后一抗孵育2h(抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA),用PBST漂洗三次,二抗孵育2h(抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA),PBST漂洗三次,然后漂洗三次,最后用NBT/BCIP显色,结果一片空白。。。
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请问版主,最近western 经常遇到一个怪问题,我在转模前制作三明治的时候,仔细检查过没有气泡,也用波棒擀过,但每次转完膜后当我掀起滤纸后,总是很伤心的发现:胶与膜之间有数个明显的气泡,不明白呀?why?

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染膜后检测
如果有气泡处条带完整就没有什么大问题
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