蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  206/610 |‹‹‹204205206207208209210211212213›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2051

发表于 2013-2-27 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
SDS-PAGE之后，胶经过了考马斯亮蓝染色和甲醇脱色后，这块胶还能不能用于转膜后做WB？

==========

不能
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2052

发表于 2013-2-27 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下我的试验有何问题？？谢谢
转膜用GE按玛西亚半湿转印仪，400mA 1h，能看到预染marker已转上，然后封闭过夜（封闭液为1%的BSA，用PBS配制），然后PBST漂洗三次，然后一抗孵育2h（抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA），用PBST漂洗三次，二抗孵育2h（抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA），PBST漂洗三次，然后漂洗三次，最后用NBT/BCIP显色，结果一片空白。。。

=========================================

1、先进行蛋白电泳后的染胶，看蛋白提取情况
2、你的检测方法敏感性不够
3、目的蛋白定位在那？
4、抗体问题
顶部
one[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73393
精华 0
积分 697
帖子 1114
信誉分 100
可用分 6353
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
2053

发表于 2013-2-27 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请各位大虾分析分析一下我做的western 到底是什么原因？
我跑的是amyloid beta 42，分子量4kD，图中前面五个泳道是标准品，后面的是果蝇组织提取物，为什么全都聚集在上面了呢？同上样量有关吗?用的是16%的tricine胶。


查看积分策略说明
附件
2013-2-27 12:51
73199383.snap.jpg (23.65 KB)
 
顶部
taoshengyijiu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77450
精华 0
积分 467
帖子 614
信誉分 100
可用分 3876
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
2054

发表于 2013-2-27 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问做WESTERN的凝胶配好之后放在四度过夜之后还能用吗？
顶部
lxh031[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76425
精华 0
积分 335
帖子 389
信誉分 100
可用分 2726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
2055

发表于 2013-2-27 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、先进行蛋白电泳后的染胶，看蛋白提取情况
2、你的检测方法敏感性不够
3、目的蛋白定位在那？
4、抗体问题

==============================================================================================================

我做了两块胶，染了一块 另一块转膜，电泳跑的不错。抗体前面做了dot blot已经确定了稀释浓度，应该没问题，我的目的就是看看目的蛋白的特异性反应。另外，是不是我的半湿法转移的步骤有误？一般情况半湿法转62KD的蛋白要电压电流时间要什么
条件？
顶部
lxh031[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76425
精华 0
积分 335
帖子 389
信誉分 100
可用分 2726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
2056

发表于 2013-2-27 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有，抗体稀释的时候用PBS稀释好呢还是用含有1%BSA的PBS稀释好呢？
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2057

发表于 2013-2-27 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请各位大虾分析分析一下我做的western 到底是什么原因？
我跑的是amyloid beta 42，分子量4kD，图中前面五个泳道是标准品，后面的是果蝇组织提取物，为什么全都聚集在上面了呢？同上样量有关吗?用的是16%的tricine胶。

====================

这么小的还没做过
不知道如何回答
是电泳还没有跑出来吧
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2058

发表于 2013-2-27 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问做WESTERN的凝胶配好之后放在四度过夜之后还能用吗？

=====================

可以的
4度过夜效果会更好
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2059

发表于 2013-2-27 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了两块胶，染了一块 另一块转膜，电泳跑的不错。抗体前面做了dot blot已经确定了稀释浓度，应该没问题，我的目的就是看看目的蛋白的特异性反应。另外，是不是我的半湿法转移的步骤有误？一般情况半湿法转62KD的蛋白要电压电流时间要什么
条件？

=============================

恒流，1.2mA每平方厘米膜面积
1h30min就ok了
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2060

发表于 2013-2-27 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有，抗体稀释的时候用PBS稀释好呢还是用含有1%BSA的PBS稀释好呢？

=================================

我一般用5%奶粉PBST或者TBST来稀释
还有就是3%BSA-PBST或者TBST
顶部
 6097  206/610 |‹‹‹204205206207208209210211212213›››|