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标题:【讨论帖】western blot问题解答

kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-2-27 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1，转膜后用丽春红等染色证明转膜效果没问题
2，注意抗体孵育时膜是不是全部在液体中

=============================================================================================================

转膜结束后我用考马斯亮蓝染色，泳道的蛋白条带都有。我抗体孵育的时候是用的杂交袋，膜应该都在液体里。我用的是碧云天的预染的maker，目的在第三和第四条带之间，有没有可能是maker不准啊？
谢谢楼主！O(∩_∩)O~
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发表于 2013-2-27 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜结束后我用考马斯亮蓝染色，泳道的蛋白条带都有。我抗体孵育的时候是用的杂交袋，膜应该都在液体里。我用的是碧云天的预染的maker，目的在第三和第四条带之间，有没有可能是maker不准啊？
谢谢楼主！O(∩_∩)O~

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当然有可能是marker不准
另外做WB不要在marker上矫情
如果条带非常特异，抗体是买大公司商业化的，分子量位置有些差异，都可以确定为是目的蛋白
有些东西你可以参考Abcam公司的说明书
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-2-27 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再问一下，如果我的分离胶按30% Acr/bic（50：1）配，那么我的积层胶怎么配呢？30% Acr/bic（29：1）？还是30% Acr/bic（50：1）？
谢谢！
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发表于 2013-2-27 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再问一下，如果我的分离胶按30% Acr/bic（50：1）配，那么我的积层胶怎么配呢？30% Acr/bic（29：1）？还是30% Acr/bic（50：1）？
谢谢！

=============

与分离胶相同
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发表于 2013-2-27 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问版主，我相同的上样量和抗体浓度，有时候出现反影有时又是会背景很深很窄的条带，试过很多次了，对上样和抗体浓度也降低试过，但是又会出现白板的情况，很郁闷，不知您建议如何摸索？我的是核蛋白。ECL显影时会看到先有弱的荧光，但后面会看到背景出现，即一片荧光。非常感谢！

===========================


这种情况可能与抗体质量有关
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bs4665[使用道具]
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发表于 2013-2-27 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，我用你说得方法，恒流，恒流，1.2mA每平方厘米膜面积
1h30min ，转膜后用李春红染色，可什么都没有啊
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发表于 2013-2-27 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，我用你说得方法，恒流，恒流，1.2mA每平方厘米膜面积
1h30min ，转膜后用李春红染色，可什么都没有啊

=======================

什么都没有就不用往后做了
说明那个步骤有问题呗
你染过电泳后的胶吗？
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yychen[使用道具]
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发表于 2013-2-27 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了两块，那块电泳后染色的条带很好啊
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发表于 2013-2-27 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了两块，那块电泳后染色的条带很好啊

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1、膜过期了
2、转膜没有转上
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发表于 2013-2-27 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢版主回复，太难了，做了很久，现在还没解决。

独孤一鹤 wrote:
请各位大虾分析分析一下我做的western 到底是什么原因？
我跑的是amyloid beta 42，分子量4kD，图中前面五个泳道是标准品，后面的是果蝇组织提取物，为什么全都聚集在上面了呢？同上样量有关吗?用的是16%的tricine胶。

这么小的还没做过
不知道如何回答
是电泳还没有跑出来吧
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