小中大请教前辈：
我第一次做WB,没有条带。所以想问问具体步骤，是不是什么细节有错误。
我的样品是hiv-1病毒和producer细胞的细胞裂解液。一般情况下病毒产量都不会很少，而且已经ELISA测了病毒的衣壳蛋白p24含量和细胞裂解液的浓度。每个条带上样量是，对应100ng的p24的病毒量，或5ug总蛋白的细胞裂解液。
操作如下：（我做过很多的蛋白质电泳，电泳应该没有问题，而且预染marker很正常，凝胶是买的没有过期，整个实验室都在用，没有问题。）
湿转：190mA,1hr，两板胶。蛋白质marker使用的是bio-rad的10-250kd的marker，marker中高于75kd的条带有部分没有转完，在胶上还有一些，但是大部分都转到膜上了；marker中小分子量的条带没有问题，都转到膜上了。
问题1：转膜完成后是否需要洗膜，然后再加溶解在pbst的5% milk封闭，如果需要清洗，那么没有洗会有什么结果？
封闭：4度，过夜，没有shake，蛋白所在的那一面向上，密闭的盒子里。
问题2：封闭完成后是否需要清洗膜，再加1抗（WAK4，p24 from mouse）。如果需要清洗，那么没有洗会出现什么情况？我这次就没有洗呢，我很担心是因为没有洗造成的没有条带。wak4是什么意思呢？
1抗：WAK4 anti-p24 1000倍稀释，1hr, RT。实验室其他人使用的1000倍稀释，说没有问题，但是非特异条带会比较多，但是我的没有条带，我很郁闷呢。
洗膜3次，每次10分钟，shake，RT。
问题3：抗体用什么稀释呢？是TBST吗？
2抗：anti-mouse IgG peroxidase(sigma A9917, 我用的10000稀释，使用说明书推荐80000-160000倍稀释使用), 1hr, RT。二抗是刚刚买来的，新的，我开的封，没有人用过，所以不知道稀释倍数，如果二抗加的过多，会对结果有什么影响？
洗膜3次，每次10分钟，shake，RT。
ECL（和老板一起做的，应该没有问题）
曝光时间1秒、2秒、10秒、20秒、40秒、1分。结果2秒以内没有条带，10秒以后在条带间出现了黑色的背景，1分曝光的片子都不能看了，蛋白marker是白的，其他地方都是黑的。
问题4：蛋白质marker是否应该留着显影，曝光后蛋白质marker为什么是白的？是否正常？老板说我的结果是opposite的。因为一抗大家都在用，所以没有问题；封闭的牛奶大家都在用，也应该没问题；转膜正常；TBST是老板配的，直接给我用了，没有问题的；我想稀释抗体的操作我应该也没有问题；二抗是新买的sigma的，我不怀疑会有问题，只可能是我用的超量了；ECL试剂盒时间有些长，过期了，但是大家都在用，每个人的片子都很好，也应该没有问题，而且操作是和老板一起的，包括曝光也是和老板一起做的。所以我想是不是我的中间过程的操作细节有问题，否则至少应该有条带，而不是白板（短时间曝光）或黑板（长时间曝光）。
谢谢前辈了，真的很急，老板说明天重做，但是不知道应该怎样改进试验条件，谢谢哟
