蛋白质与蛋白组学

请教楼主，ecl液冲洗膜的时间多久比较好，有的是冲一下即可，有的人要放好几分钟。请问这有什么根据吗

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ECL液冲洗膜式什么意思？
ECL孵育还是ECL孵育完成后把ECL洗去？

楼主我近期做了两次WB，有一个共同的问题是转膜没转上，转后丽春红染色没有带，别人转的膜我一起染了有很清晰的带。我和别人用的不同的PVDF膜，不同的甲醇，不同的电泳仪。我的膜是bio rad的PVDF 0.2微米，一直保存在4度冰箱，有塑料袋包裹，不知道保存多长时间了，看盒子上也没有使用期限，没有保存温度。甲醇我用的是北京化工厂的，10块一瓶的，09年产。电泳仪我的比较低挡，以前是跑DNA电泳的，不能恒流，我是手动一直看着它维持电流在200mA左右，不稳，在190-210mA间浮动，我的蛋白30-40KD，转3h。蛋白上样量100ug，蛋白提的没问题，我跑过蛋白胶考染很漂亮。我的操作自认为问题不大，跟别人的一样，就算有瑕疵也不会造成完全转不上膜的情况。近两次WB丽春红染后虽然没带，有一次继续做免疫反应和曝光，没有任何着色。
通过我的这些描述，楼主你能指出我的问题在哪吗？

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用你同学的PVDF膜试试

请教楼主：
凝胶转膜后，PVDF膜经封闭后，可以在4度放多长时间呢？还有怎样做内参呢，在什么情况下需要做内参？二抗的稀释度怎样测？二抗的说明书上的检测方法是dot/blot，不明白这是什么意思？谢谢前辈了

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dot blot你可以搜我以前的帖子，有详细的说明，需要用NC膜来做
PVDF膜封闭放置4度没试过
-20度半年没问题
如果你需要半定量的时候就需要做内参
内参怎么做方法同你目的蛋白的抗体孵育及检测

请教楼主：

最近做western总出问题，一直在改善条件，最近又出新问题了，请教老师帮分析一下：
1 发光以后背景很高，好像是所有蛋白条带都有，目的条带强一些，可是图没法用，而且蛋白marker没有条带，但是在暗室可以看到目的条带，看不到发光MARKER,压片后很多非特异性的条带。
2 又做一次换了NC膜，转完膜整个膜都花了，有些地方膜上白色的东西掉了，像掉漆了一样，一片一片的，无法继续试验，是膜的问题还是其他问题？有人说是膜干了，但用之前用转膜缓冲液浸泡了10分钟的。电泳100伏45分钟浓缩胶，150伏70分钟跑分离胶，跑完胶上有9条预染MARKER的条带。转膜用300毫安120分钟，预染MARKER转到膜上了，很淡，但是用TBST漂洗后就掉了，会是什么原因呢？

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你用湿转还是半干转？
背景的问题与洗膜及二抗浓度太高有关
加大洗膜次数
降低二抗浓度

想问下您知道dtt母液如何配制及保存条件吗？
做双向的时候要用

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2M DTT，MQ水配制
-20度分装保存

请教一个关于2×SDS样品缓冲液的配制问题：

参阅《分子克隆实验指南》（第2版），配方如下：

100mmol/L Tris.HCl,pH 6.8
200mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
4% SDS
0.2% 溴酚蓝
20% 甘油

书中提到不含DTT的缓冲液可室温保存，临用前加入1mol/L DTT贮存液。1mol/L DTT贮存液的配制方法：用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

请问这个怎么过滤啊？
是不是这个过滤步骤是必须的？
是否可以不加DTT？

谢谢！

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常用的是还原电泳，需要用DTT，如果不用可以用beta-巯基乙醇代替
我一般都不过滤