蛋白质与蛋白组学

楼主最近得你的指点，弄明白了很多问题。再次感谢！这次我用脑组织提的蛋白做WB的actin，蛋白用BCA试剂盒定量，上样量分别是左65ug和右100ug。转膜完用立春红染色什么没有，然后继续做封闭1h，一抗1：400过夜，二抗1：4000两小时。加底物时看见右道光较明显，左道光很弱，但是有光。压片两次分别3min和30min，显影结果如图：3min的只能看见右道有黑点，大小在45附近差不多对，30min才勉强看到左道有浅浅的东西。后来考染膜的图像在右侧。请问：
1，我爆出来的椭圆形黑点是带吗？实验室有人说不是带，是背景，带应该是条形。
2，膜用立春红染没有带，后来考染有带是什么原因？是上样量少吗？可是我上了65-100ug不够多吗。
3，我在北方，长春，冬季很冷，暗室里也凉，这对底物反应和显色曝光有没有影响？明明左道有光却曝的极弱是什么原因？
4，看我考染的膜，条带不是很清晰，是转膜的问题吗？该怎么改进？
谢谢！

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你用的是纯化后的蛋白吗？
考染的结果有点像纯化后的膜
不像是提取组织总蛋白的条带，我认为问题可能出现在这
你提的蛋白条带太少了

dot blot你可以搜我以前的帖子，有详细的说明，需要用NC膜来做
PVDF膜封闭放置4度没试过
-20度半年没问题
如果你需要半定量的时候就需要做内参
内参怎么做方法同你目的蛋白的抗体孵育及检测

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谢谢前辈的指点，已经放-20度保存了，准备慢慢的用来优化条件

你用的是纯化后的蛋白吗？
考染的结果有点像纯化后的膜
不像是提取组织总蛋白的条带，我认为问题可能出现在这
你提的蛋白条带太少了

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我的蛋白就是组织提取的总蛋白，没经过纯化。我单独跑过蛋白胶考染，蛋白条带实际上是很多的，如图的前两道。转完膜就是这个样子，请问是什么原因？

我的蛋白就是组织提取的总蛋白，没经过纯化。我单独跑过蛋白胶考染，蛋白条带实际上是很多的，如图的前两道。转完膜就是这个样子，请问是什么原因？

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1，膜过期没有
2，用什么转移体系？
3，转移条件

ECL液冲洗膜式什么意思？
ECL孵育还是ECL孵育完成后把ECL洗去？

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是ecl现象的时间，不是把ecl洗去。另外楼主请教您个问题，我要把b-actin蛋白制成0.25mg每ml的浓度 ，上样10微克，可actin得斑点总也出不来，请问是我的溶液配制的不对吗？我用1倍sample buffer溶解的b-actin。谢谢

请教楼主：

最近做western总出问题，一直在改善条件，最近又出新问题了，请教老师帮分析一下：
1 发光以后背景很高，好像是所有蛋白条带都有，目的条带强一些，可是图没法用，而且蛋白marker没有条带，但是在暗室可以看到目的条带，看不到发光MARKER,压片后很多非特异性的条带。
2 又做一次换了NC膜，转完膜整个膜都花了，有些地方膜上白色的东西掉了，像掉漆了一样，一片一片的，无法继续试验，是膜的问题还是其他问题？有人说是膜干了，但用之前用转膜缓冲液浸泡了10分钟的。电泳100伏45分钟浓缩胶，150伏70分钟跑分离胶，跑完胶上有9条预染MARKER的条带。转膜用300毫安120分钟，预染MARKER转到膜上了，很淡，但是用TBST漂洗后就掉了，会是什么原因呢？

你用湿转还是半干转？
背景的问题与洗膜及二抗浓度太高有关
加大洗膜次数
降低二抗浓度

谢谢楼主：
我用的是湿转。洗膜TBST洗10分钟3次。二抗1：5000稀释。

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你只上了一个样品吗？

1 上面是改进后的图，背景太高，应该出现两条距离很近的带，可是基本分不清楚。以为条带很亮，只压片30秒，显影时一看到条带就定影大概20秒。请教老师，压片，显影，定影的时间一般是多久。如何调整好一些？
2 这次条带发光时间特别短只有1~2分钟就焠灭了，基本没时间调整，往常会亮十分钟左右，不知道是什么原因？

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二抗浓度还是太高
荧光淬灭与HRP浓度有关，太高淬灭快
另外金属物质也容易造成这种现象

你只上了一个样品吗？

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谢谢楼主：
1.扫描的时候片子是竖放的，上了8个样。有一个是对照，条带都出来了，就是不清楚，应该有两条的，发光时也可以看到两条，但是压片后就融合了，而且背景很高，条带不清晰。
2.封闭完了要洗膜吗？用TBST?
3.请教TBST与TBS在作用上有什么不同？什么时候用TBS？什么时候用TBST？