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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-1 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主：
1.扫描的时候片子是竖放的，上了8个样。有一个是对照，条带都出来了，就是不清楚，应该有两条的，发光时也可以看到两条，但是压片后就融合了，而且背景很高，条带不清晰。
2.封闭完了要洗膜吗？用TBST?
3.请教TBST与TBS在作用上有什么不同？什么时候用TBS？什么时候用TBST？

才开始做，很多东西不懂，麻烦fangweibin119老师了！谢谢

======================================================

封闭完成后用TBST漂洗一次即可进行后续步骤
TBST就是在TBS中加入0.05%~0.1%Tween-20或者Triton X-100
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发表于 2013-3-1 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主，之前您有告诉我为了分离胶更好的交联 ，可在4度进行。那么是配好后直接放入还是室温一段时间再放入。因为我试过直接放入过夜后第2天上浓缩胶，发现电泳条带很弥散？谢谢！
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发表于 2013-3-1 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主，之前您有告诉我为了分离胶更好的交联 ，可在4度进行。那么是配好后直接放入还是室温一段时间再放入。因为我试过直接放入过夜后第2天上浓缩胶，发现电泳条带很弥散？谢谢！

==============================================

配好后直接放在4度能聚合的更好
或者配制好后放在RT 等聚合后放在4度过夜
电泳条带的弥散与你的：1）胶缓冲液有关（Tris-HCl）
2）样品缓冲液
3）样品缓冲液中的还原剂等
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发表于 2013-3-1 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：
我做的指标是一个磷酸化蛋白，但抗体没有标明是磷酸化的抗体（abcam的）但可以做WB。
蛋白分子量是156，做了两个月了，也没有目的条带，Actin有。
免疫组化出结果了，不知道WB哪个环节出问题了？提蛋白的时候是不是需要加磷酸酶来去磷酸化呢？
谢谢
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发表于 2013-3-1 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教版主：
曝光后很多非特异性条带，连预染MARKER都出来了，为什么呢？
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发表于 2013-3-1 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
接上帖，最亮的那个应该是目的条带，但是为什么很不规则呢？
曝光后将膜清晰后增强发光，即重新封闭加一抗二抗再暴光，非特异条带是不见了，可是目的条带也只剩两条了，形状很怪异，请问可能是哪里出了问题呢？谢谢
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发表于 2013-3-1 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：
我做的指标是一个磷酸化蛋白，但抗体没有标明是磷酸化的抗体（abcam的）但可以做WB。
蛋白分子量是156，做了两个月了，也没有目的条带，Actin有。
免疫组化出结果了，不知道WB哪个环节出问题了？提蛋白的时候是不是需要加磷酸酶来去磷酸化呢？
谢谢

=================================

1，做磷酸化蛋白一定要用磷酸化抗体
2，提取蛋白时需要加入磷酸酶抑制剂
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发表于 2013-3-1 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教版主：
曝光后很多非特异性条带，连预染MARKER都出来了，为什么呢？

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1，预染marker也是蛋白，有些是天然蛋白纯化，有些是重组表达蛋白，既然是蛋白那么肯定会有些抗体有反应
2，非特异性条带有没有关系，要能确定目的条带才行。非特异性条带与你的抗体本身及抗体的稀释度有关
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发表于 2013-3-1 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
接上帖，最亮的那个应该是目的条带，但是为什么很不规则呢？
曝光后将膜清晰后增强发光，即重新封闭加一抗二抗再暴光，非特异条带是不见了，可是目的条带也只剩两条了，形状很怪异，请问可能是哪里出了问题呢？谢谢

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条带的形状与电泳有关
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发表于 2013-3-1 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问下，每次加ECL去压片的时候，压片的时间长短都会影响目的条带的灰度

得出的不同批次的条带都不一样，即使同一批的样品重复几次的灰度结果都会不一样

这个时候应该怎么分析啊？
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