蛋白质与蛋白组学

最近做一对不同样本中目的蛋白的定量比较，杂了b-actin后发现很难保证上样量相同，我是一块胶同样的一对样品重复上样(40ug)，结果两两比较时actin一会高一会低，请问对于这种定量比较实验，老师有什么好的经验可以传授一二？比如备样，上样，转膜和曝光，其中有哪些要特别注意？O(∩_∩)O谢谢

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1，转膜时没有压好胶与膜
2，抗体孵育不完全
3，上样时样品有没有完全上进上样孔

请问我要检测血清里的蛋白，蛋白浓度有什么要求吗

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蛋白浓度调整至4mg/ml左右
浓度太高变性时容易有沉淀产生

我有2个目的蛋白，分别是110kD和130kD，用上述仪器和试剂，麻烦楼主推荐个转膜条件。

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恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
110K与130K都可以选择2h30min

1，可以用90V，溴酚蓝跑到分离胶调整电压150V
2，两种膜都可以用
3，转膜1.2mA每平方厘米，恒流，30min~40min
4，二抗点膜的话在干的NC膜上直接点稀释好的二抗，不用封闭等。在室温干燥后直接用ECL曝光，显影

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谢谢斑竹，但是关于二抗点膜还是不太明白，是转膜后待膜干了，再点二抗吗，能不能将步骤给我讲讲，直接点二抗就能显影是什么原理呢，谢谢

1，转膜时没有压好胶与膜
2，抗体孵育不完全
3，上样时样品有没有完全上进上样孔

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谢谢老师！您的建议很有启发！还想接着问一下：
1，转膜时没有压好胶与膜：我是湿转的，做三明治的时候每一层都用试管擀过，还多加了一层滤纸（一般两面各一层），是不是还有些细节没做到？
3，上样时样品有没有完全上进上样孔：我是用吉尔森的黄枪头上样，是不是用专用的加样针会好些？或者是上样太慢？我每次都同时跑两块胶，加进去的样又扩散了？

此外是不是上样的时候先稀释一下样品，上样体积大一点会更好的控制误差呢？

再次感谢！

谢谢老师！您的建议很有启发！还想接着问一下：
1，转膜时没有压好胶与膜：我是湿转的，做三明治的时候每一层都用试管擀过，还多加了一层滤纸（一般两面各一层），是不是还有些细节没做到？
3，上样时样品有没有完全上进上样孔：我是用吉尔森的黄枪头上样，是不是用专用的加样针会好些？或者是上样太慢？我每次都同时跑两块胶，加进去的样又扩散了？

此外是不是上样的时候先稀释一下样品，上样体积大一点会更好的控制误差呢？

再次感谢！

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3，上样时样品有没有完全上进上样孔：我是用吉尔森的黄枪头上样，是不是用专用的加样针会好些？或者是上样太慢？我每次都同时跑两块胶，加进去的样又扩散了？
用10ul的白枪头来加样

斑竹你好，我是已把之前的帖子都看了一遍了，学了不少知识，但是关于二抗点杂交您没作过详细的步骤介绍啊，劳烦您再给讲讲
还有半干转1.2mA每平方厘米，我膜很小的，15～20平方厘米吧，那不就是说电流用的很小？
我蛋白22K现用15%分离胶，5%浓缩胶，电泳时电压大小和分子量什么关系呢，大电压的话跑的时间比较短，小蛋白会不会容易跑过了呢，谢谢

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1，电泳时溴酚蓝跑至胶底部，22K蛋白肯定还在胶内
2，蛋白在浓缩胶内一般用80V或者90V跑，溴酚蓝进入分离胶后改称150~180V
电压不能太高
3，转膜电流是很小
4，用PBS稀释二抗，1：1000，2000，4000，8000，。。。。
在NC膜上把每个梯度的稀释二抗点膜：每个点1ul
在室温下干燥后加上ECL孵育，孵育完成后进行曝光操作