蛋白质与蛋白组学

版主，你好！可否帮我分析下western结果？

================================================================

1、你的电泳跑的很好
2、转膜时间不需要这么长，以我的经验 300mA恒流，30min
3、从结果来看一抗浓度太高，需要继续稀释一抗，做一个梯度，稀释2、5、10倍
4、二抗可以直接用TBST稀释，RT孵育30~40min就行

多谢版主的解答，这两天按照你提供的建议重新做一下。
另外，还有一个问题想问问你，我们订的一个进口封闭液到了，是GenWay公司的，我看其产品介绍它是Phosphate Buffered saline/fish gelatin配制的封闭液。我看了园子里的一些帖子，用AP标记，BCIP/NBT显色的最好不要用PBS Buffer的。我打算用Phosphate Buffered saline/fish gelatin来封闭，用它来稀释一抗，一抗反应后再用TBST洗3次，二抗用TBST稀释，反应 1 h，最后用BCIP/NBT显色。这样是否可以？是否我得改用PBS buffer，不用TBST buffer了，但这样又不能用BCIP/NBT来显色了。
麻烦版主了！

====================

直接用TBST不就行了啊
你们那配置TBST麻烦？

请教大家几个问题：
1、我做的是人肿瘤细胞，钙网蛋白（calreticulin， CRT/CALR），刚开始用的是abcam的兔源多抗ab4，怎么都没有条带，投诉后换了同样是兔多抗的ab2904，条带出来了（单一且位置符合）。但是现在由于做co-IP，换了个其他实验室使用的很好的stressgen的鼠单抗，居然又没有出来（条件和他们实验室一样，甚至增加了3倍的浓度，延长孵育时间都没有），而且用的是同一张膜，先用的abcam的兔多抗,条带很强，但是由于和IgG重链没有分开，所以重新洗膜后再孵stressgen的鼠单抗，结果连阳性对照都没有出来，再用同一张膜重新孵育abcam的兔多抗，又出来了，这是什么原因呢？

===========================================================

还是抗体的原因，换成1：1000，4度48小时，室温2小时，条带就出来了。

2、接上面的问题，对于同一张膜，同一个蛋白使用不同的来源的抗体，条带应该在一个位置吗？

==

在

3、再接上面的问题，我的IP目的蛋白是64KDa，IgG重链是50，我现在用的是12.5%的胶，120V跑上层，80V下层跑3小时，结果由于IgG太强，掩盖了目的蛋白的信息，本来想换鼠源性的抗体来回避这个问题的，但是由于那个鼠源性的抗体一直没有出来，那只有在兔源抗体上想办法了。我除了降低IP的抗体浓度以外（厂家只说可以做IP，但是没有推荐浓度，ICC的推荐浓度是1/300，我这次做IP用的是1/100），还想通过改变下层胶的浓度是电泳时间来再将64-50两个条带拉开一些，有没有什么建议啊？有说如果电泳时间过长会使条带弥散，最长可以跑多长时间？

=========================================================

降低IP抗体浓度至1：300，换成8%的下层胶80V3小时，条带分开了。