小中大版主，你好！
就我的western blot问题再此向你请教。
我做的是香蕉果实一个转录因子的western，大小26 kDa左右，上样30 ug，我们做过考染，条带比较清晰，抗体是委托公司通过原核表达，蛋白纯化和兔血清纯化得来的，我们的转膜条件是100 毫安转5 h，封闭液是订购GenWay公司的。4度封闭过夜。
第一次做的一抗浓度1：2000（封闭液稀释），反应3 h，二抗（羊抗兔AP标记，promeag公司）使用浓度1：5000（采用TBST稀释），反应1 h。NBT和BCIP显色。得到的结果是杂带多，目的条带为图片箭头所示（见图1）。
按照你给的意见，第二次做的一抗浓度1：5000，反应3 h，二抗（羊抗兔AP标记，使用浓度1：5000，反应2 h，得到的结果是条带少，且目的条带很微弱。而其中一个大小在50 kDa左右的杂带非常明显（见图2）。
同时，我们还做了一个二抗为HRP标记的，一抗浓度1：5000，反应3 h，二抗（抗兔HRP标记，使用浓度1：5000，反应2 h，普利莱超敏发光液ECL显色，孵育3 min，压片1.5 min，奇怪的是，这次显示出来的一个很明显的杂带在15-10 kDa之间，而目的条带也不是非常明显（见图3）。
是不是我第二次做的一抗浓度过低？还有，我第二次做的两张图片，只是二抗不同，显色方法不一样，显示出来的明显杂带怎么会差别这么大？请版主再帮忙分析下，多谢了！
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1、我认为一抗的特异性不是很好，不知道你是做了Protein A纯化还是抗原亲和纯化后的抗体？
2、二抗与样品中的蛋白有非特异性结合，你可以直接用AP、HRP标记的二抗与转膜后的膜上蛋白反应进行检测，以确定是不是二抗对蛋白有非特异性结合
3、一抗的可能性比较大
