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标题:【讨论帖】western blot问题解答

kswl870[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，又一次来请教你了。
根据前两次你的意见，今天重新做了一次，ECL显色后杂带很少，背景也不错，就是出来的两条带与预测的分子量差别较大，预测应该是在26 kDa左右出现条带，但实际出来的两条带分子量在10 kDa左右。具体见图片，转膜是100毫安，5h，室温封闭2 h，然后4度封闭过夜，一抗1比3000，反应3 h，二抗1比5000，反应2 h，ECL发光液孵育3min（是普利莱超敏发光液），压片 5 min。
恳请版主再帮忙分析下，这次出现的分子量大小不一致的原因是什么？难道是转膜过程中目的蛋白出现了降解？如果是这样，如何改进呢？
非常感谢版主！


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tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想请问一下以下两个问题
1.内参怎么选择：我要测的是从SD大鼠分离的一种细胞的一个磷酸化蛋白的表达，不知道具体该买哪种内参？一定要做内参吗？
2.我的一抗写着 Applications: IHC:1:50-1:100，请问是什么意思，是使用时的稀释比例吗？
非常之感谢！急用！
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发表于 2013-3-2 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好！我的胶片洗出来的时候都是片子中间黑色有的脱落，还有显影液黑色絮状的，还能不能用啊？谢谢啊
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的整个背景都很黑，想知道什么原因？
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发表于 2013-3-2 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我补充一下，我要检测的是p38。
提蛋白问题：我孵育的是12孔板，是消化后在加裂解液裂解，还是裂解后用细胞刮刮下来呢？裂解液中是不是可以加PMSF和另一种磷酸化酶抑制剂？
多谢，敬请老师尽量早些回复我哦。
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发表于 2013-3-2 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的实验有两个处理，每个处理有六个样品，请问做western blot的话，是否这12个样品都要在一张胶上同时做呢？一般western 每个处理做几个样品啊？
为什么看到的图片大多数一个处理只有一条带呢，这能说明问题吗？
还有一个问题，我的实验要检测3种蛋白的表达量有无差异，内参要做几次啊？
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发表于 2013-3-2 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现正在做WB，有一些问题难以解决，希望fangweibin119可以给我解疑释惑。我做的是小分子蛋白，分子量在37、21KD，用10%的胶跑，转膜是恒流280mA,1小时。但是在实验中发现每次转膜后，PVDF膜上Mark（师姐留下来的，德国公司）条带都不明显，蓝色条带几乎没有，红色的隐约可见，ECL发光可见目的蛋白条带影，只是条带表现为分组不明显，粗、黑或者呈圆点状不成线状，请老师指点一下，谢谢！
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发表于 2013-3-2 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现在有一个棘手的问题,我在做WB之前用酶标仪定了上样的总蛋白量,但做了ACTIN后却总不能达成一致.总是不一致.请问这估计是什么原因?有什么比较好的解决办法?谢谢,急盼解答

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1、用什么定量方法？
2、蛋白定量准确性如何
3、可以通过内参的WB结果，计算积分光密度（IOD），然后再调整总蛋白上样量
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发表于 2013-3-2 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，又一次来请教你了。
根据前两次你的意见，今天重新做了一次，ECL显色后杂带很少，背景也不错，就是出来的两条带与预测的分子量差别较大，预测应该是在26 kDa左右出现条带，但实际出来的两条带分子量在10 kDa左右。具体见图片，转膜是100毫安，5h，室温封闭2 h，然后4度封闭过夜，一抗1比3000，反应3 h，二抗1比5000，反应2 h，ECL发光液孵育3min（是普利莱超敏发光液），压片 5 min。
恳请版主再帮忙分析下，这次出现的分子量大小不一致的原因是什么？难道是转膜过程中目的蛋白出现了降解？如果是这样，如何改进呢？
非常感谢版主！

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1、分子量怎么不标上呢
2、你用的什么Marker？
3、不同的marker在不同的胶浓度里表现是不一样的
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发表于 2013-3-2 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想请问一下以下两个问题
1.内参怎么选择：我要测的是从SD大鼠分离的一种细胞的一个磷酸化蛋白的表达，不知道具体该买哪种内参？一定要做内参吗？
2.我的一抗写着 Applications: IHC:1:50-1:100，请问是什么意思，是使用时的稀释比例吗？
非常之感谢！急用！

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1、内参肯定是要用的，而且最好能做非磷酸化蛋白
2、不知道你的分子量多少，如果是总蛋白的话可以参考用beta-tubulin 55K，beta-actin 43K，GAPDH 37K，选择与你分子量差异较大的内参
3、Applications: IHC:1:50-1:100 意思是免疫组化应用的稀释度是1：50-100
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