蛋白质与蛋白组学

你好！我的胶片洗出来的时候都是片子中间黑色有的脱落，还有显影液黑色絮状的，还能不能用啊？谢谢啊

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显影液成酱油色就不能用了

我的整个背景都很黑，想知道什么原因？

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1、二抗浓度高
2、一抗特异性不好
3、ECL质量较差
4、曝光时间较长
5、显影时间太长
6、胶片被整体曝光了

你好，我补充一下，我要检测的是p38。
提蛋白问题：我孵育的是12孔板，是消化后在加裂解液裂解，还是裂解后用细胞刮刮下来呢？裂解液中是不是可以加PMSF和另一种磷酸化酶抑制剂？
多谢，敬请老师尽量早些回复我哦。

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1、可以再12孔板直接加裂解液，不用消化
2、裂解液中要加蛋白酶、磷酸酶抑制剂与PMSF（PMSF现用现加，在水溶液里30分钟降解）

我的实验有两个处理，每个处理有六个样品，请问做western blot的话，是否这12个样品都要在一张胶上同时做呢？一般western 每个处理做几个样品啊？
为什么看到的图片大多数一个处理只有一条带呢，这能说明问题吗？
还有一个问题，我的实验要检测3种蛋白的表达量有无差异，内参要做几次啊？

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1、所有样品都做最好、然后每个样品重复三次（当然没有必要这么做）
2、内参最好每次都做

现正在做WB，有一些问题难以解决，希望fangweibin119可以给我解疑释惑。我做的是小分子蛋白，分子量在37、21KD，用10%的胶跑，转膜是恒流280mA,1小时。但是在实验中发现每次转膜后，PVDF膜上Mark（师姐留下来的，德国公司）条带都不明显，蓝色条带几乎没有，红色的隐约可见，ECL发光可见目的蛋白条带影，只是条带表现为分组不明显，粗、黑或者呈圆点状不成线状，请老师指点一下，谢谢！

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1、可以选择12%分离胶
2、Marker过期了？是不是反复冻融次数太多？
3、曝光结果可能是洗膜不彻底照成的

1、分子量怎么不标上呢
我已经标出分子量了。

2、你用的什么Marker？
我们用的Bio-Rad的Precision Plus Protein standards（双色）marker，共8条带，从250-10 kDa，转膜后可以看到marker都转到膜上了，但在杂交洗膜过程中，marker颜色强度逐渐减弱，曝光后在X胶片上只出来两条带。

3、不同的marker在不同的胶浓度里表现是不一样的
我们的浓缩胶是3%，分离胶是12%（采用如下单体贮液：丙烯酰胺19.55g，甲叉0.45 g，定容到50 ml）

这两天换不同样品杂交，还是出来这两条带，当时公司给我一抗的时候，纯化出来的蛋白分子量是26 kDa，现在我们杂交出来的条带差10 kDa，杂交结果可否用呢，出现这样的情况是啥原因呢？多谢版主了。

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你检测的是纯化后的蛋白还是内源性蛋白？
有可能是你的目的条带降解了