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标题:【讨论帖】western blot问题解答

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

斑竹好，最近在做施万细胞的两个神经生长因子受体p75和TrkA的表达情况，是不是需要用专门的膜蛋白裂解液来提这两个蛋白啊，用一般的组织蛋白裂解液不知能否？谢谢！
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ending[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
，打算这几天更换一下Tris-Hcl再看看。另外还有几个问题想再请教一下老师。
1、溴酚蓝跑得比较弥散，在积层胶（5%）时也不能压成线，应考虑哪些方面的影响？
2、marker是否需要变性？说明书上提示不能煮沸，可师姐说要变性，究竟是应该怎样做？
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owanaka[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主好！
我是新手，刚接触WB，我老板的医院之前一直不做WB，师兄们都在学校做，都是现成的东西做，到我时因为在医院做了，所以试剂、抗体等都要自己买，如果买abcam的抗体，自己摸条件，想请教版主大概的预算经费。多谢了~~
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢老师，下次我计数了我再请教您。还有问题哦：
1.您能否给我推荐一个电泳和转膜的条件以及一抗二抗的稀释度等？
2.做磷酸化蛋白是不是一般都该用BSA封闭呢；一抗二抗怎么稀释呢，是不是也该用含百分之几的BSA的TBST稀释？
3.转膜时用恒压或者恒流有什么区别，我该用什么呢
我还没有做过Western，自己的师兄师姐也都没有做这方面的实验，问题可多了，很希望能得到您的建议，麻烦了
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

遇到个古怪的情况，郁闷好几天了，请教下高人。蛋白64kd，电泳没什么问题，上样量也算过了40~60ug，跑完marker很清楚。之后转膜，安装没问题，电转液没问题，270mA，70min之后，膜上染色没条带，胶染过没条带，连marker都不见了。有什么地方可能会有问题呢？因为样品较少，希望能先现找到错误，再尝试。多谢啦！
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.想请问一下，我们实验室做WB，在isolation完protein之后，按1：1的比例加好laemmli buffer，加热30min后-80℃保存，然后上样时按照测得的浓度和蛋白量得到上样的体积（每个孔的体积都是不一样的）这样的方法严谨么？

谢谢啦
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，感谢您已经回答了这么多问题。您已经就二抗稀释度操作详细解答，但是如何确定最佳稀释度，我有疑问，我已经做完点杂交，但因为各稀释度都阳性且没有背景，是否须进一步稀释二抗。我用的是super signal显影，二抗稀释已经达100000。是否选择阴性结果的前一稀释为最合适？多谢。
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发表于 2013-3-2 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
斑竹，您好！非常感谢您的解答。我现在还是把我整个western blot 的过程写一下：
首先我的目的蛋白是分子量为55kDa.5%的浓缩胶，10%的分离胶。电泳在浓缩胶是80v。到分离胶是150v。湿转100mA 100分钟。5%的脱脂奶粉室温2-3小时。一抗4度过夜，洗膜 二抗37度一小时 洗膜 加发光液 显影 谢谢 我的整个这个可合适，因为一直都没做出来。谢谢

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1、一抗稀释度不合适或者一抗质量不好，与抗原没有反应
2、ECL敏感性太低
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发表于 2013-3-2 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看了您的WB经验后，很受启发，先感谢您的无私分享。
我现在也在做WB，我的内参b-actin（42KD）做的相当好，但是我的目的蛋白FAK（125KD）、phospho-FAK（125KD）的都没有做出来。我用的细胞分别为Hela及NIH3T3细胞　细胞数量为100万左右，收集细胞后，直接用国内公司的RIPA试剂加PSMF裂解。经考染后，发现总体蛋白条带不是很亮，特别是100KD以上的，我想是不是因为国产的RIPA的效果不大好，细胞蛋白的提量太少了？想请教您：您用的是国产还是进口的RIPA，或是自己配制的？效果如何？可否给点建议。谢谢先。

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我用自己配制的裂解液
我们公司卖的裂解液产品也是我配制的
效果还可以吧
100K以上蛋白本身含量并不高
可以先加大上样量试试
另外你用的什么一抗、ECL？
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发表于 2013-3-2 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我还怀疑是不是自己操作出问题，我就是按试剂说明书操作的：1.100万细胞加200ul的RIPA　buffer现加2ul的PMSF；2.吹打细胞，冰浴20min；3.4度，12000转离心10min,收集上清到新管。没感觉自己出了什么问题，为什么我的细胞目的蛋白就那么少呢？

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减少RIPA的使用量
步骤及过程没有问题
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