蛋白质与蛋白组学

打算这几天更换一下Tris-Hcl再看看。另外还有几个问题想再请教一下老师。
1、溴酚蓝跑得比较弥散，在积层胶（5%）时也不能压成线，应考虑哪些方面的影响？
2、marker是否需要变性？说明书上提示不能煮沸，可师姐说要变性，究竟是应该怎样做？

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marker是否需要变性要看说明书
如我们公司我配制的marker就是不需要变性的

斑竹好，最近在做施万细胞的两个神经生长因子受体p75和TrkA的表达情况，是不是需要用专门的膜蛋白裂解液来提这两个蛋白啊，用一般的组织蛋白裂解液不知能否？谢谢！

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我刚做过Trk B，用santa的一抗，效果很好
不需要专门提取膜蛋白来做
1、用提取总蛋白的RIPA强即可
2、选择敏感性高的ECL

谢谢老师，下次我计数了我再请教您。还有问题哦：
1.您能否给我推荐一个电泳和转膜的条件以及一抗二抗的稀释度等？
2.做磷酸化蛋白是不是一般都该用BSA封闭呢；一抗二抗怎么稀释呢，是不是也该用含百分之几的BSA的TBST稀释？
3.转膜时用恒压或者恒流有什么区别，我该用什么呢
我还没有做过Western，自己的师兄师姐也都没有做这方面的实验，问题可多了，很希望能得到您的建议，麻烦了

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1、电泳及转膜条件是一个复合的选项，大部分时间与经验有关，不能给你确切的答复。不知道你的蛋白分子量及胶的厚度等
2、最好选择用BSA，3~5%BSA-TBST均可
3、转膜恒压与恒流与个人习惯有关，都可以选择，我习惯恒流

遇到个古怪的情况，郁闷好几天了，请教下高人。蛋白64kd，电泳没什么问题，上样量也算过了40~60ug，跑完marker很清楚。之后转膜，安装没问题，电转液没问题，270mA，70min之后，膜上染色没条带，胶染过没条带，连marker都不见了。有什么地方可能会有问题呢？因为样品较少，希望能先现找到错误，再尝试。多谢啦！

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确定转膜电极没有装反？
样品转膜前SDS-PAGE染过吗？

1.想请问一下，我们实验室做WB，在isolation完protein之后，按1：1的比例加好laemmli buffer，加热30min后-80℃保存，然后上样时按照测得的浓度和蛋白量得到上样的体积（每个孔的体积都是不一样的）这样的方法严谨么？

谢谢啦

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不严谨
用1×的loading补足

您好，感谢您已经回答了这么多问题。您已经就二抗稀释度操作详细解答，但是如何确定最佳稀释度，我有疑问，我已经做完点杂交，但因为各稀释度都阳性且没有背景，是否须进一步稀释二抗。我用的是super signal显影，二抗稀释已经达100000。是否选择阴性结果的前一稀释为最合适？多谢。

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不用继续稀释了
二抗稀释度的选择选择一个中间梯度

请问，我打算做一个分子量400kd的胞浆蛋白，请问分离胶，浓缩胶该用什么浓度啊，还有跑胶时的电压改用多少呢，以及300ma转膜，大概需要多长时间谢谢，我也是刚做，不吝赐教！

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能做梯度胶吗？最好用梯度胶
如果没有梯度胶可以选择6%分离胶
电泳时间延长
300mA 3h差不多了

请教版主：
电泳时定压状态下，电流非常小，除了电泳仪的问题外，其他还存在哪些因素？
定压80V时，电流只有不到10mA，定压120V时也只有十几mA。
谢谢斑竹^_^

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电泳时定压状态下，电流本来就较小