小中大我最近也在跑wb，从细胞中提取的总蛋白，上样量为20ug，250mA 湿转55min，5%脱脂奶粉室温封闭1h，4度摇床孵一抗过夜，二抗1：6000（中杉进口分装），碧云天ECLplus发光，压片：
1 检测p53（中杉分装的santa的单克隆抗体，1：250稀释）可检测到平行的两行条带，均清楚整齐，但并非每次都出现，是否封闭不足？
2 检测cyclinD1（中杉分装的santa的单克隆抗体，1：250稀释），ECL曝光10min才见压片很弱的条带，是否蛋白上样量不足？
3 检测p21(bioworld国外原装小包装抗体，1：250稀释，推荐1：500-1：1000）始终无条带，是否转膜过度或应该用22um的PVDF?
4 用BCA检测蛋白浓度后，是将每个样品的浓度稀释至一致后再上同样体积还是调整每个样品的上样体积使总蛋白量一致？
Thank you!
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要调整每个样品的上样体积一样、总蛋白量一致
P21建议换抗体
P53的情况你要查你的样品的背景信息，有些就是很弱
cyclin D1 建议曝光时间延长至30min，应该就可以了
