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标题:【讨论帖】western blot问题解答

wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有两个问题请前辈指点下：
1.提取的核蛋白可以用β-Actin作为内参么？
2.同样的WB条件，但每次出来的条带都不一样（也有时候是前几个泳道的带出来了，有时候又是另外几个泳道的条带出来），但是Mark都能出来，这是什么原因呢？
谢谢先！！！
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gogo[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的蛋白分子量是220，上样按100ul上的，湿转3.5小时，牛奶封闭了10min,一抗1：200用牛奶稀释4°过夜，二抗1：1500 2小时，显色甬道很深，目的蛋白很浅，我该怎么做？
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2013-3-2 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用自己配制的裂解液
我们公司卖的裂解液产品也是我配制的
效果还可以吧
100K以上蛋白本身含量并不高
可以先加大上样量试试
另外你用的什么一抗、ECL？

===============================================================================================================

谢谢您的回复。
我用的一抗是从文献中查到的，分别购于SIGMA和Calbiochem公司。ECL为碧云天公司。我还想请教您：直接从细胞板上加提取液提取细胞　和把细胞消化到EP管中，再加提取液有取别吗？我比较下，从板上直接提取蛋白的要好很多，不知您有没有这样的经验？ 您在哪家公司，不方便公开说，就短信告诉我吧，谢谢先。
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发表于 2013-3-2 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多大分子量蛋白？

============================================================

就是TH，60左右吧，我们用的一抗浓度是1：200，000，会不会太低了呢?
另外想问下版主，如果我想查使用多少浓度的抗体，该去哪里找呢？
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发表于 2013-3-2 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教老师：

1.我想重复使用用曝过光的膜，是必须洗脱抗体重孵一抗还是不洗脱直接再孵二抗就行？

2.我用两株不同细胞的蛋白裂解物做WB，孵同一种一抗，结果是一株曝出两条带（其中一条是目的大小，另一条距离很近），而另一株就只有一条目的条带，这可能是什么原因？

谢谢！
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发表于 2013-3-2 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问，第一次做，我有三个蛋白要做WB，一个是28kD、57kD、130KD，请问可在同一条件下跑胶，及胶的浓度？转膜的时候条件是什么？时间，电压等，谢谢！
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c86v[使用道具]
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发表于 2013-3-2 14:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

检测磷酸化p38蛋白表达量的，分子量38kDa,电泳浓缩胶80v，分离胶150v；转膜可以恒流多大及多长时间比较合适呢？
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发表于 2013-3-2 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第一张是湿转，恒压60V，90min转膜后，胶考染的结果，蛋白转的很斑驳，不知道什么原因

这一张是p-P 70（89KD左右）的BLOT图，不知道是不是目的条带


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附件
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80609546.snap.jpg (13.11 KB)
 
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guagua[使用道具]
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发表于 2013-3-2 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这张膜对应的胶，我们也进行考染了，结果请看附件

我们想问的问题是：1 从第一张图片来看，我们转膜过程存在什么样的问题，可能的原因在哪？有什么建议吗（我们用的是Invitrogen 4%-12%的预制胶） 2 第二张图上，100KD底下的那条带是不是目的蛋白p-P70呢？条带斑驳的原因会不会是蛋白转的不好呢?
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-3-2 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是一名新手，做大鼠海马钙调蛋白，内源性的，分子量：16.7kd，版主建议用0.22um孔径膜，是不是用0.45的就做不出结果？另外劳烦版主给一点转膜（湿转）的建议。谢谢
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